新疆哈族奶酪中产蛋白酶非发酵剂乳酸菌的筛选及其系统发育分析

杜紫萱，卢士玲，王晓雯，芦文娟，魏玉霞，李宝坤*

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

新疆哈族奶酪中产蛋白酶非发酵剂乳酸菌的筛选及其系统发育分析

杜紫萱，卢士玲，王晓雯，芦文娟，魏玉霞，李宝坤*

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

以采集10份新疆塔城地区哈萨克族牧民自制的奶酪为原料，用改良的ROGOSA和MRS两种培养基对其分离纯化，共筛选出43株菌种，其中球菌32株，杆菌11株。对筛选出的菌株进行产蛋白酶和菌株自溶能力测定，结合生理生化特性和16S rDNA序列同源分析和建立系统发育树分析，对挑选出的10株优势菌进行了菌株分子生物学鉴定，鉴定结果表明：菌株R6-6自溶度最高，为42.32%；而自溶度最低的菌株为R4-4，达到6.21%；菌株R2-2、R4-2、R4-7为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epiderm idis）；菌株R3-5、R10-6为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）；菌株R3-2为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；菌株R6-6为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）；菌株R9-5、R9-6为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。其中产蛋白酶的最优势非发酵剂乳酸菌（NSLAB）菌株为乳酸片球菌（P. acidilactici）。

哈萨克族奶酪；非发酵剂乳酸菌；蛋白酶；鉴定

新疆少数民族素有食用奶酪的传统习惯，并且新疆民族特色奶酪历史悠久、制作讲究、风味独特，是少数民族人民必食的奶制品之一，酸奶疙瘩等自制的奶酪制品遍布牧民家中，有的牧民把自养奶牛所产牛奶的50%以上用于制作奶酪供长年食用［1］。新疆哈萨克族乳酪是一种独具民族特色，集营养性、安全性于一体的风味食品，在营养学界享有“奶黄金”的称号［2］。采用传统发酵方式对奶酪进行制作，选用经过几千年的世代相传和自然选择的优良的微生物制成，风味独特。

非发酵剂乳酸菌（non-starter lactic acid bacteria，NSLAB）是奶酪微生物中的一种独特的菌群，属于奶酪外源微生物，存在于所有的天然奶酪中。关于NSLAB的种类，目前研究较为成熟的有嗜温乳酸杆菌（Mesophilic lactobacilli）、片球菌（Pediococci）、肠球菌（Enterococci）及明串珠球菌（Leuconostoc）［3］四类，但在部分研究中，也有将微球菌（M icrococci）列入非发酵剂乳酸菌的报道［4-5］。近10年来，国外研究者对奶酪中的非发酵剂乳酸菌的组成、影响微生物生长的因素等方面进行了大量研究。但国内在这方面的研究报道较少［6］。蛋白酶是一种重要的工业用酶，其生产几乎占酶制剂市场的65%以上［7］，广泛运用于食品、药物、皮革制备、蛋白水解和纺织工业等［8-9］。何捷等［10］在对新疆传统酸奶中，利用透明圈法筛选出一株高产蛋白酶的乳酸菌，经生理生化试验和16S rRNA序列比对鉴定为发酵乳杆菌，为我国发酵食品提供了新的乳酸菌资源。张咚咚等［11-12］则对产蛋白酶的乳酸菌进行研究，采用16S rRNA同源性分析对高产蛋白酶乳酸菌的筛选及鉴定。本实验以哈萨克族普通农户家庭的自制奶酪中非发酵剂乳酸菌为基础，在厌氧条件下，对产蛋白酶的乳酸菌进行了筛选分离纯化，并进行生理生化试验及16S rDNA同源性比对，希望能将获得的高产蛋白酶NSLAB菌株进行筛选并建立系统发育分析。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原料

采自新疆塔城地区的10份不同的哈萨克族牧民家自制的传统奶酪，样品经采集后装入无菌袋密封，封口后立即放入便携式自制冰箱内，间隔一定时间更换冰袋保持在较低的温度下带回实验室后，将样品放入-4℃冰箱保存，及时对样品进行分离培养。

1.1.2培养基

改良的ROGOSA培养基［13］：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、磷酸二氢钾6 g/L、乙酸钠2.5 g/L、硫酸镁乙酸钠0.58 g/L、硫酸锰乙酸钠0.15 g/L、硫酸亚铁0.03 g/L、吐温-80 1 m L、琼脂20 g/L、蒸馏水1 000 m L。

MRS培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L、葡萄糖、吐温80、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸三铵2 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、琼脂20 g/L和蒸馏水1 000 m L。

蛋白酶测定采用改良MRS培养基：在MRS培养基的基础上加入2%的脱脂乳粉。

以上培养基均在115℃条件下灭菌20 min。

1.1.3化学试剂

0.85%无菌生理盐水、50×TAE缓冲液、无水乙醇（分析纯）、丙三醇（分析纯）、脱脂乳粉、细菌基因组总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒（离心柱型）、溶菌酶、MarkerⅠ、2×PCR M ixture、ddH2O：天根生化科技（北京）有限公司；GoldView：北京索莱宝科技有限公司。

1.2仪器与设备

5417R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；TC-512PCR扩增仪：意大利Techne公司；DNP-9272电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；MP-502B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；Gel.Doc2000凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司；W-CJ-1C无菌操作台：苏州安泰空气技术有限公司；LD2X-50KB蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DYY-8C电泳仪：北京市六一仪器厂。

1.3实验方法

1.3.1NSLAB的分离及纯化

参照樊哲新等［13］对新疆酸驼乳NSLAB的筛选及鉴定方法，对纯菌株进行革兰氏染色，镜检观察菌体形状、大小等，同时进行接触酶试验，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》将革兰氏染色阳性、接触酶阴性的菌株初步判定为NSLAB。纯菌株用终浓度为50%的甘油保藏于-18℃冰箱备用。

1.3.2产蛋白酶NSLAB菌株的筛选

产蛋白酶NSLAB的筛选采用加入脱脂乳粉（2%）MRS培养基［14］。操作方法：经液体培养基增菌后，选择适宜的稀释菌液用移液枪接种于MRS+2%脱脂乳粉培养基平板上，接种量为10 μL，置于37℃生化恒温培养箱中培养24 h，以菌落透明圈（水解圈）作为初筛依据。

1.3.3产蛋白酶NSLAB的自溶度的测定

将连续活化两代的菌株，低温离心（5 000 r/min、15 min、4℃），将收集到的菌体用磷酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.8）［15］洗涤2次，并重悬于磷酸钠缓冲液中，30℃培养24 h后，分别测定培养初始和24 h的OD645nm值。自溶度的计算公式如下：

式中：A1为菌体初始悬浮液吸光度值；A2为菌体培养24 h吸光度值。

1.3.4产蛋白酶NSLAB生理生化试验

参照参考文献［16-17］，将菌株分别进行硝酸盐还原试验、运动性试验、产气试验等。通过生理生化试验根据结果初步鉴定菌株。

1.3.5产蛋白酶NSLAB菌株16S rDNA分析

（1）纯菌株DNA的提取

按照细菌基因组总DNA提取试剂盒（离心柱型）说明书的操作要求提取NSLAB菌株的DNA：其中第二步添加了溶菌酶，37℃水浴30 min，目的是破坏NSLAB的细胞壁。

（2）在质量方面，因路桥施工过程中涉及很多隐蔽工序，这些工序的质量能否得到保证，关键在于按照设计要求与现行规范来完成所有工序，并在此基础上落实三检制，即班组内自检、班组间互检和交接检查，把好质量大关，完成验收并确认合格后，才能正式进入到下一道工序当中，经过逐层检查与严格把关，保证工程整体质量[2]。

（2）16S rDNA片段的PCR扩增

对NSLAB 16S rDNA进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR采用50 μL扩增体系：DNA稀释液2μL，上游、下游引物各2μL，2×PCRM ixture 25μL，ddH2O 19 μL。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物为341F（5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3），下游引物为805R（5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3）。

PCR反应条件：95℃预变性10 min，35个循环（95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果在凝胶成像仪中观察。委托生工生物工程（上海）股份有限公司对PCR产物进行测序，测序结果通过美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上的局部序列比对基本检索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序进行序列同源性比对。

2　结果与分析

2.1NSLAB分离纯化结果

2.1.1菌株形态特征

图1　菌株菌落形态（a，b）及革兰氏染色（c，d）Fig．1 Colony morphology（a，b）and gram staining（c，d）of strains

2.1.2产蛋白酶NSLAB菌株的筛选结果

由于菌株产蛋白酶后水解培养基中脱脂乳粉蛋白，使得原本不透明的培养基变透明。以菌落透明圈作为初筛依据，选取的每个样品分离出来的菌进行产蛋白酶NSLAB菌株筛选，结果见表2，部分菌株菌落透明圈的产生情况见图2。由表2中43株菌落透明的产生情况可以看出，有32株菌产蛋白酶，产蛋白酶达到74.4%。由图2可知，菌株R3-2、R4-7、R7-1产蛋白酶周围都有明显水解圈，菌株R3-3则没有水解圈的产生，说明菌株R3-3不产蛋白酶。选取产蛋白酶的32株菌进行NSLAB菌株复筛。

图2　NSLAB水解脱脂乳产生透明圈Fig．2 Transparent circle of skim m ilk hydrolyzed by NSLAB

表2　NSLAB产蛋白酶水解圈情况Tab le 2 Situation of pro tease hyd rolysis circ le of NSLAB

NSLAB的自溶受很多因素影响，所谓的自溶即是在一定的条件下，细胞自身的类水解细胞壁肽聚糖的网络结构，造成细胞裂解［18］。NSLAB快速自溶会带来可观的经济效益，因为自溶可以使大量的胞内酶得以释放，可以加速干酪的成熟过程，大大的缩短了干酪的成熟周期，可降低生产成本。但是在生产乳酸菌发酵剂时，要求大量、高活力发酵剂菌体的生物量积累，然而菌体细胞在增殖的过程中会发生自溶，因此很难使NSLAB的活菌数达到较高的水平。因此，NSLAB自溶的快慢直接关系到干酪成熟的速度及其品质［19-20］。选取产蛋白酶的32株菌进行自溶度测定，结果见图3。

图3　菌株培养24 h自溶度Fig.3 Autolysis rate of strains culturing for 24 h

由图3可知，32株菌的自溶能力各不相同，存在个体差异，与其所在种属并无太大的关系。其中菌株R6-6自溶度最高，为42.32%；而自溶度最低的菌株为R4-4，达到6.21%；其余菌株的自溶度均在此范围内变化。表明32株菌均有一定自溶度，但是具有一定差异性。

2.1.3菌株综合分析

通过分离纯化、革兰氏染色试验、镜检分析和接触酶试验，菌株产蛋白酶能力及自溶度的测定，从10种样品分离得到的43株菌中初步筛选出菌株R2-2、R3-2、R3-5、R4-2、R4-7、R5-2、R6-6、R9-5、R9-6、R10-6。这10株菌革兰氏染色呈紫色，接触酶为阴性，产蛋白酶能力强，自溶度高，是具有优良性状的NSLAB。

2.2菌株生理生化试验结果

将初步筛选出的10株具有优良性状的NSLAB经生理生化试验初步鉴定，结果见表3。由表3可知，10株菌中，葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）3株，其共同特点为可利用多种碳水化合物，硝酸盐还原反应呈阳性等；乳杆菌属（Lactobacillus sp.）3株，其共同特点为15℃能生长，但在45℃环境下生长非常缓慢，反应较弱，能发酵果糖和葡萄糖，几乎不能利用阿拉伯糖，利用半乳糖能力相对较弱。片球菌属（Pediococcus sp.）4株，其共同特点为无运动性，不产芽孢，不可发酵蔗糖、甘露醇，但可以利用果糖、阿拉伯糖、半乳糖等。

表3　菌株生理生化试验结果Table 3 Results of physiological and biochem ical experiments of strains

2.3菌株16S rDNA分析结果

通过对10株菌株的16S rDNA序列的PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到清晰的特异性条带，片段大小均在400～500 bp之间，电泳图结果见图4。

对10株NSLAB进行进一步分子学鉴定，通过扩增各菌株的16S rDNA基因序列，并与NCBI数据库中的已知序列进行比对，选择与其相似性最高的典型菌株，进行相似性分析，并使用Mega5.05软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ），自展值（bootstrap）设为1 000构建系统发育树，结果见图5。

由图5可知，菌株R5-2与Pediococcus lolii的同源性为99%，菌株R3-5、R10-6与乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的同源性分别为99%、100%，因Pediococcus lolii在NCBI数据库中属于乳酸片球菌种（Pediococcus acidilactici），即将菌株R5-2、R3-5和R10-6共同鉴定为乳酸片球菌；菌株R3-2与戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）同源性达到100%，即鉴定为无糖乳杆菌；菌株R6-6与干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）同源性为100%，即将其鉴定为干酪乳杆菌；菌株R9-5、R9-6与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）同源性分别为100%、99%，故将其鉴定为鼠李糖乳杆菌；菌株R2-2、R4-2、R4-7与表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的同源性均达到100%，即可鉴定为表皮葡萄球菌。ADDIS E等［21］在蓝纹干酪中分离出了葡萄球菌和微球菌，发现接触酶呈阴性的表皮葡萄球菌与微球菌之间的界限并不是很清晰，它们均表现出一定程度的蛋白质和脂肪水解能力，增强干酪风味。此外，伯杰手册第七版中也将表皮葡萄球菌划入了微球菌属，本研究结果与之相符。

图4　菌株16S rDNA的PCR扩增电泳图Fig.4 16S rDNA PCR am p lification elec trophore togram of stra ins

图5　基于16S rDNA序列的NSLAB系统发育树Fig.5 Phy logenetic tree of the NSLAB based on 16S rDNA sequence

3　结论

以采集自新疆塔城地区的10份哈萨克族牧民自制的奶酪为原料，筛得非发酵剂乳酸菌43株，其中球菌32株，杆菌11株。并对菌株的产蛋白酶能力及其自溶度进行测定，结果表明，在43株菌中有32株菌在加入2%的脱脂乳粉培养基中产生透明的水解圈，说明菌株产蛋白酶水解了脱脂乳粉中的蛋白质，而产蛋白酶菌株达到74.4%；选取产蛋白酶的菌株测定自溶能力，而菌株自溶能力与其所在种属并无太大的关系，存在个体差异，菌株R6-6自溶度最高，为42.32%；而自溶度最低的菌株为R4-4，达到6.21%；

最后，结合生理生化特性，利用16S rDNA序列同源分析和建立系统发育树分析对挑选出的10株菌进行了分子鉴定，鉴定结果表明，菌株R2-2、R4-2、R4-7为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）；菌株R3-5、R10-6为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）；菌株R3-2为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；菌株R6-6为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）；菌株R9-5、R9-6为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。

在对新疆塔城哈族牧民自制奶酪中筛得的菌株中，种类并不多，其中产蛋白酶的优势NSLAB菌株为乳酸片球菌属（P.acidilactici）。

［1］马燕，倪永清，卢士玲，等.新疆特色干酪中乳酸菌的分离鉴定［J］.中国酿造，2011，30（8）：38-40.

［2］马春燕，新华·那比，刘红梅.哈萨克族传统发酵乳酪中发酵菌的分离鉴定［J］.中国乳品工业，2010，38（4）：7-9，19.

［3］CASEY M G，HÄNI J P，GRUSKOVNJAK J，et al.Characterisation of the non-starter lactic acid bacteria（NSLAB）of Gruyère PDO cheese［J］. Dairy Sci Tech，2006，86（9）：407-414.

［4］DALEVP G.Utilisation of waste feathets from pourtry slaughter for produetion of a protein coneentrate［J］.Bioresource Technol，1994，48（2）：265-267.

［5］吴非，张寒冰，刘晓玲.干酪加工中的牛奶内源酶和非发酵剂乳酸菌［J］.中国乳品工业，2006，34（8）：52-54.

［6］周蕊，李晓东，潘超.促熟干酪的非发酵剂乳酸菌筛选及其对干酪浆模型蛋白质降解的研究［J］.食品科学，2012，33（1）：131-135.

［7］RAO M B，TANKASALE A M，GHATGE M S，et al.Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases［J］.M icrobiol M ol Biol Rev，1998，62（3）：597-634.

［8］JOHNVESLY B，NAIK G R.Studies on production of thermostable alkaline protease from thermophilic and alkaliphilic［J］.Process Biochem，2001，37（2）：139-144.

［9］HAKI G D，RAKSHIT S K.Developments in industrially important thermostable enzymes：a review［J］.Bioresource Technol，2003，89（10）：17-34.

［10］何捷，曾小群，吕鸣春，等.新疆酸奶中高产蛋白酶与产脂肪酶乳酸菌的筛选［J］.食品科学，2015，36（17）：130-133.

［11］张咚咚，安家彦，姜铁民，等.传统发酵乳中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及鉴定［J］.食品科技，2013，38（8）：5-8.

［12］陈超，高学军，刘营，等.产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化［J］.乳业科学与技术，2008，11（4）：160-162.

［13］樊哲新，李宝坤，李开雄，等.新疆酸驼乳NSLAB的筛选及鉴定［J］.食品工业科技，2015，36（3）：170-174.

［14］徐建国，田呈瑞，胡青平，等.高产蛋白酶菌株的筛选及产酶条件优化［J］.中国粮油学报，2010，25（10）：112-115.

［15］方芳，冀林立，张彦斌，等.产耐热蛋白酶乳酸菌的筛选、产酶条件及其酶学性质的研究［J］.食品科学，2008，29（10）：375-379.

［16］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［17］凌代文.乳酸菌分类鉴定及实验方法［M］.北京：中国轻工业出版社，1999.

［18］孙卓，吕加平，张佳程，等.乳酸菌自溶对切达干酪成熟中蛋白质分解的影响［J］.中国乳品工业，2010，38（12）：12-14，40.

［19］王秋宇，梁爱云，李晓东，等.非发酵剂乳酸菌的诱变选育及对干酪促熟的研究［J］.食品工业，2013（5）：63-66.

［20］崔文明，刘鹭，张书文，等.保加利亚乳杆菌LJJ自溶的影响因素分析［J］.食品与发酵工业，2013，39（7）：6-12.

［21］ADDIS E，FLEET G，COX J，et al.The grow th，properties and interactions of yeasts and bacteria associated w ith the maturation of Camembert and blue-veined cheeses［J］.Int J Food M icrobiol，2001，69（1）：25-36.

Screening of protease-producing non-starter lactic acid bacteria from Xinjiang Kazak cheese and its phylogenetic analysis

DU Zixuan，LU Shiling，WANG Xiaowen，LU Wenjuan，WEI Yuxia，LI Baokun*
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A total of 43 strains were screened from 10 pieces of the Kazak homemade cheese in Xinjiang Tacheng prefecture by improved ROGOSA and MRS medium，in which 32 strains were Coccus and 11 strains were Bacillus.The ability of protease-producing and autolysis of strains were determ ined.Combined w ith physiological and biochemical characteristics，16S rDNA sequence homology and phylogenetic tree analysis，the 10 dom inant strains selected were identified by molecular biology method.The results showed that the autolysis rate of strain R6-6 was the highest of 42.32%，and the autolysis rate of strain R4-4 was the lowest of 6.21%.Strain R2-2，R4-2 and R4-7 were identified as Staphylococcus epiderm idis，strain R3-5 and R10-6 were identified as Pediococcus acidilactici，strain R3-2 was indentified as Pediococcus pentosaceus，strain R6-6 was indentified as Lactobacillus casei，and strain R9-5 and R9-6 were identified as Lactobacillus rhamnosus，in which the non-starter lactic acid bacteria（NSLAB）with high protease-producing was identified as P.acidilactici.

Kazak cheese；non-starter lactic acid bacteria；protease；identification

Q939．97

0254-5071（2016）05-0020-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．005

2016-03-04

国家自然基金地区项目（31560444，31460007）；国家自然基金青年项目（31201395，31301523）；兵团博士基金专项（2014BB005）；石河子大学重大科技攻关项目（gxjs2014-zdgg07）；石河子大学高层次人才启动项目（RCZX201223）

杜紫萱（1991-），女，硕士研究生，研究方向为畜产品加工与安全。

李宝坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向为畜产品加工与质量安全。