核磁共振氢谱法定性鉴定甘露聚糖肽

夏　玮,　沈艳红,　付　迪,　张文清,　宛燕飞,　张　力

(1.华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室,上海 200237; 2.成都利尔药业有限公司,成都 610083)



核磁共振氢谱法定性鉴定甘露聚糖肽

夏玮1,沈艳红1,付迪1,张文清1,宛燕飞2,张力2

(1.华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室,上海 200237; 2.成都利尔药业有限公司,成都 610083)

建立了核磁共振氢谱法定性鉴定甘露聚糖肽的方法,选择异头氢区(δ4.89～5.90)作为“指纹”鉴定区,以甘露聚糖肽标准品氢谱为参照图谱,将鉴定的样品谱图与其比较,采用相关系数法计算样品谱图与标准谱图的相似度,并对该方法的特异性、重复性及精密度进行验证。经鉴定,9个不同批次的甘露聚糖肽样品的鉴定结果均与标准图谱一致,相似度均大于0.95,该方法具有很好的专属性。核磁共振氢谱法用于甘露聚糖肽的定性鉴定,具有操作简便、重复性好、专属性强等优点。

核磁共振氢谱法; 甘露聚糖肽; 定性鉴定

甘露聚糖肽是中国首创的一种新型免疫促进剂,原名多抗甲素(Polyactin A,PAA),是从健康人咽喉部分离的α-溶血性链球菌33号菌株经深层培养、发酵提取而得到的一种糖肽类物质,具有抗血小板聚集、抗病毒、抗菌和抗呼吸系统感染等多种生物活性[1],临床上被广泛用于恶性肿瘤的辅助治疗、白细胞减少症和呼吸道反复感染等领域[2-4]。

核磁共振氢谱法是多糖组成和重复单元结构鉴定的有效方法,在分析过程中无需对多糖进行降解或者衍生,能分析不同多糖结构之间的细微差异,也能显现少量内源性和外源性的污染物[5-6]。目前,核磁共振氢谱法被美国药典[7]、欧洲药典[8]、英国药典[9]和中国药典2010版[10]收录,是欧洲药典和WHO(World Health Organization)推荐的多糖质量控制方法[11]。文献[12]曾报道采用核磁共振氢谱法,选择异头氢区域定性鉴别细菌多糖,特异性和重现性都优于之前使用的比色法,同时也适用于其他多糖试剂。

目前,甘露聚糖肽质量标准中采用化学显色方法、红外光谱法对其进行鉴别,但这些鉴别方法专属性均不强,因此需建立一种专属性强、操作简便、重复性好的鉴别方法,以用于甘露聚糖肽的质量控制。本文拟采用核磁共振氢谱法对甘露聚糖肽进行定性鉴定,为其质量控制及质量标准的提高提供科学依据。

1　材料与仪器

甘露聚糖肽对照品(批号:140652-200401,中国药品生物制品检验所),TSP (Trimethylsilyl-propionic)(氘代度98%,美国Sigma公司),重水(氘代度99.8%,北京希凯创新科技有限公司),甘露聚糖肽供试品(批号:140401,140501,140502,131101,131102,110901,G100102,091202,成都利尔药业有限公司),板蓝根糖肽(广州白云山和记黄埔中药有限公司),云芝糖肽(南京森贝伽生物科技有限公司),腊梅花多糖(实验室提取),葡甘露聚糖(纯度>99%,西安瑞盈生物科技有限公司),半乳甘露聚糖(纯度>99%,西安大丰收生物科技有限公司)。

DD2400-MR核磁共振仪(安捷伦科技有限公司),METTLER AE240型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)。

2　实验方法

2.1溶液的配制

2.1.1TSP重水溶液的配制准确称取10 mg 氘代TSP(3-三甲基硅基丙酸钠),溶于5 mL D2O中,配成2 g/L的TSP重水溶液。

2.1.2样品溶液的制备准确称取甘露聚糖肽对照品及供试样品各30 mg,加入0.5 mL 的D2O,超声至完全溶解,加入10 μL 2 g/L的TSP重水溶液,超声混合均匀,转移至5 mm的核磁样品管中。

2.2NMR测试条件

1H-NMR的共振频率为400 MHz,采样参数如下:脉冲序列(seqfil) s2pul,扫描次数(ct) 64,空扫次数(ss) 0,谱宽(sw) 8 012.8 Hz,脉冲角度(pw) 45,采样时间(at) 2.556 s,接收增益(gain) 10,测试温度(temp) 30 ℃,弛豫延迟时间(d1) 1.0 s,窗函数线宽因子(lb) 0 Hz。

2.3核磁共振氢谱法定性鉴定甘露聚糖肽

参照细菌多糖核磁鉴定方法[12],测定甘露聚糖肽供试品的1H-NMR谱,将特征鉴别区谱图峰型和峰位移值与甘露聚糖肽对照品谱图进行比对,谱图相似度的测定采用相关系数法[13],采用Microsoft EXCEL软件来分析所选定光谱区的数据,将供试品谱图的Y轴坐标与对照品图谱的Y轴坐标进行比较,计算相关系数r,如果r>0.95,认为两者结构一致; 反之,则认为是未知样品。

2.4方法学验证

2.4.1特异性分别按2.1节中的样品溶液制备方法及2.2节中的核磁条件测定葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖以及市售的其他种类多糖及糖肽类物质(板蓝根糖肽、云芝糖肽、腊梅花多糖),与甘露聚糖肽标准谱图的峰型和谱峰位移值比对,并计算相似度,评价该方法的特异性。

2.4.2重复性对同一批次的甘露聚糖肽供试品,按2.1节中的样品溶液制备方法平行制备三份溶液,按2.2节中的核磁测定条件测试,与甘露聚糖肽标准谱图的峰型和谱峰位移值比对,并计算相似度,评价该方法的重复性。

2.4.3精密度在不同日期的同一时间,在2.2节中的核磁测试条件下,对同一甘露聚糖肽供试品进行测试,与甘露聚糖肽标准谱图的峰型和谱峰位移值比对,并计算相似度,评价该方法的精密度。

3　实验结果

3.1鉴定区域的选择

甘露聚糖肽主要由甘露糖组成,还含有少量葡萄糖及氨基酸(4%～6%)。糖链主链由1,6-甘露糖残基构成,支链由1,2-,1,3-和末端连接的甘露糖残基构成,在1,2,6-甘露糖残基的O-2位形成分支点。图1示出了30 ℃时甘露聚糖肽标准品的1H-NMR图谱,谱图信号主要集中在δ3.20～5.80之间,分为两个区域:(1) 异头氢区,δ5.80～4.40;(2) 环质子区,δ4.40～3.20。根据参考文献[14],可将大部分信号进行归属,其中,δ:5.29,5.14,5.12,5.08,5.04,4.90分别为1,2-、1,3-、1,2,6-、1,2,6-1-和1,6-连接甘露糖残基的异头氢信号。

图1　甘露聚糖肽标准品的1H-NMR谱图(30 ℃)Fig.1　1H-NMR spectrum of mannatide standard(30 ℃)

从低场至高场,甘露聚糖肽1H-NMR谱中每个信号均可作为甘露聚糖肽鉴定的数据来源,但异头氢区信号与其他信号相比,重叠干扰少,分辨率高,而且该区域谱峰化学位移、峰形与糖链重复单元中不同连接方式糖残基的异头质子一一对应。因此,选择异头氢区域作为甘露聚糖肽定性鉴定的指纹鉴定区域。在异头氢区右侧,HDO峰很高,会影响鉴定结果,因此鉴定区右端(高场)选择不能小于4.89,多糖的异头氢信号δ的选择一般不会超过5.70,鉴定区左端(低场)界限设定为5.90。

3.2实验条件的优化

3.2.1定标物的选择理想的定标物要求化学惰性、易溶于溶剂、定标物谱图信号对样品信号不产生干扰。NMR实验所用定标物一般有TMS(四甲基硅烷)、DSS (3-三甲基硅基丙磺酸钠盐)、TSP (3-三甲基硅基丙酸钠)等[15]。TMS不溶于水,而甘露聚糖肽样品由于极性较大,易溶于水,必须采用重水作为溶剂,因此可采用DSS或TSP作为定标物。但DSS结构中有3个亚甲基在1H-NMR谱中均有强信号出现,且为多重峰,可能与样品中的信号相干扰。因此,本实验选择氘代TSP为定标物。

3.2.2测试温度的选择由于甘露聚糖肽中1,6-连接的甘露糖残基含量很低,其异头氢信号(图2中D峰)很弱。又因其化学位移与水峰很接近,导致在常温(25 ℃)下以肩峰形式出现在溶剂峰的左侧。因此,考虑采用升高温度的方式将溶剂峰移向高场,如图2所示。随着温度的升高,溶剂峰移向高场,而1,6-连接的甘露糖残基异头氢信号化学位移改变很小,但温度升高也对核磁探头的寿命有一定影响。当温度升至30 ℃,1,6-连接的糖残基异头氢信号已基本与水峰分离,因此,综合考虑各因素的影响,将测定温度设为30 ℃。

3.2.3样品浓度的选择核磁共振的信号强度与所测定物质的含量直接相关,质量浓度越高,信号相对越强; 反之,噪声相对越强。样品浓度的选择要考虑样品溶液的溶解性、流动性和谱图的信噪比等,要求样品在达到良好信噪比的情况下,也具备良好的溶解性及流动性。在30 ℃、采样64次情况下,考察不同浓度的甘露聚糖肽对照品的δ5.29峰的信噪比(表1)和样品溶液的均匀性(目测)。当质量浓度达到60 g/L时,谱图信噪比良好,继续增大浓度会导致样品的溶解性和流动性较差,增加前处理及匀场的困难,故选择60 g/L的质量浓度作为样品测试浓度。

图2　核磁测试温度的考察Fig.2　1H-NMR spectra of mannatide at different temperatures

3.2.4扫描次数的选择为保证良好的信噪比,在30 ℃、采样64次情况下,对扫描次数进行优化,考察扫描8、16、32、64、128次,δ5.29处谱峰信噪比的变化,结果见表2。综合考虑仪器的时间效率、信噪比等因素,将样品测定的扫描次数定为64次。

表1　样品浓度的考察结果

表2　扫描次数对信噪比的影响

3.2.5弛豫延迟时间的选择在30 ℃、采样64次情况下,考察不同弛豫延迟时间(1、2、5、10 s)对δ5.29处峰信噪比的影响,结果见表3。可见,弛豫延迟时间对δ5.29处谱峰信噪比影响不大,考虑仪器测试的时间效率,将弛豫延迟时间设定为1 s。

表3　弛豫延迟时间对信噪比的影响

3.3甘露聚糖肽的定性鉴定

在上述优化条件下,测定9个不同批次的甘露聚糖肽样品(2009～2014年生产)的1H-NMR谱(图3),参照细菌多糖核磁鉴定方法,选择图谱上 (δ4.9～6.0)区为特征鉴别区,与甘露聚糖肽对照品核磁谱图峰型和峰位移值进行比对,并采用相关系数法计算谱图与标准谱图的相似度,具体计算方法如下:将对照品及供试品的1H-NMR谱数据转化为ASCII形式的XY数据文件(其中X为化学位移,Y为信号强度),采用Microsoft EXCEL软件来分析所选定光谱区的数据,将光谱文件的Y轴坐标与标准图谱的Y轴坐标进行比较,计算相关系数r。如果计算所得的样品图谱与标准图谱峰型和峰位移值一致,并且两者间相关系数大于0.95,则可认为鉴定的样品与对照样品结构一致; 反之,测试样品与对照品结构不一致,谱图相似性结果如表4。可以看出,9个不同批次的甘露聚糖肽供试品的核磁谱图与对照品谱图峰型及峰位移值几乎完全一致,相关系数均大于0.96,说明该方法可以定性鉴别甘露聚糖肽样品。

3.4方法学验证

3.4.1特异性为了验证方法的专属性,在相同条件下测定了与甘露聚糖肽组成类似的葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖的核磁谱图(图4)。葡甘露聚糖的单糖组成同甘露聚糖肽相似,也是由葡萄糖和甘露糖两种单糖组成,但连接方式目前认为是由葡萄糖和甘露糖通过β-1,4-吡喃糖苷键结合的杂多糖,在主链甘露糖C3位上存在着通过β-1,3键结合的支链结构[16]; 半乳甘露聚糖是由半乳糖和甘露糖构成的杂多糖,与甘露聚糖肽类似,糖链主链也是由甘露糖组成,但其结构是由β-1,4-D-甘露糖构成的主链上,通过α-1,6-糖苷键连接有单个的D-半乳糖分支[17]。可以看出,由于连接方式的差异,导致两种甘露聚糖异头氢区域的信号与甘露聚糖肽信号差异很大,两者与甘露聚糖肽标准品的相关系数r仅有-0.280 1,-0.157 9(远远小于0.95),可见,该方法具有很强的特异性。

表4　供试品与对照品谱图的相似度

1-Mannatide standard; 2-091202 (for oral);3-110901 (for oral);4-G100102 (for oral);5-131101 (for injection);6-131102 (for oral);7-131102 (for injection);8-140401 (for injection);9-140501(for injection);10-140502(for injection)

图3甘露聚糖肽供试品1H-NMR叠加谱图

(截取δ4.9 ～ 6.0区域)

Fig.3Overlay1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ4.9～6.0) of the tested mannatide

此外,在相同测定条件下,对市售的几种其他多糖及糖肽类产品进行了核磁测定(图5)。结果表明,几种样品在异头氢区域峰型及峰位移值与甘露聚糖肽对照品谱图差别更大,腊梅花粗多糖、云芝糖肽、板蓝根糖肽的谱图与甘露聚糖肽对照品谱图的相关系数r分别只有0.560 4,0.045 7,-0.039 8(远远小于0.95),进一步说明该方法具有很高的特异性。

图4　甘露聚糖肽(1)、葡甘露聚糖(2)和半乳甘露聚糖(3)的1H-NMR谱叠加图(截取δ 4.9～6.0区域)Fig.4　Overlay 1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ 4.9～6.0) of mannatide(1),gluco- mannan(2) and galactomannan(3)

3.4.2重复性3份平行制备的甘露聚糖肽供试品溶液谱图如图6所示。可以看出,3个样品谱图各特征质子化学位移和峰型均一致,和对照品之间的相关系数分别为0.990 9,0.991 3,0.997 6,可见该方法具有较好的重复性。

3.4.3精密度同一甘露聚糖肽供试品于不同日期同一时间下测定,结果如图7所示。各谱图特征质子化学位移和峰型均一致,和甘露聚糖肽对照品之间的相关系数分别为0.991 1,0.994 8,0.990 5,可见该方法具有较高的日间精密度。

图5　甘露聚糖肽(1)、板蓝根糖肽(2)、云芝糖肽(3)和腊梅花 多糖(4)的1H-NMR叠加谱图(截取δ 4.9～6.0区)Fig.5　Overlay 1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ 4.9～6.0) of mannatide(1),radix isatidis glyco- peptide(2),polysaccharopeptide(3),wintersweet flower polysaccharide (4)

图6　三份平行制备的甘露聚糖肽供试品的1H-NMR谱图 (截取δ 4.9～6.0区)Fig.6　Overlay 1H-NMR spectra (δ 4.9～6.0) of three parallel mannatide

图7　甘露聚糖肽供试品不同日期检测三次的1H-NMR谱图 (截取δ 4.9～6.0区)Fig.7　Overlay 1H-NMR spectra (δ 4.9～6.0) of mannatide tested at three different days

4　结　论

采用核磁共振氢谱法定性鉴定甘露聚糖肽,以甘露聚糖肽标准品的1H-NMR谱作为标准图谱,以异头氢区作为特性鉴定的光谱区,将供试品谱图与标准图谱峰型及峰位移值对比,采用相关系数法计算选定光谱区的相似度。结果表明,该方法具有操作简单、重复性好、特异性强、精密度高等优点,可以解决目前甘露聚糖肽现有质量标准中鉴别方法专属性不强的问题,可为甘露聚糖肽的质量控制提供更好的手段。需要说明的是,如果样品纯度比较差,所含杂质在异头氢区域也会出峰,则会对甘露聚糖肽的鉴定产生干扰。因此该方法只适合纯度比较高的样品。

[1]宋刚,干信.甘露聚糖肽生物活性的研究进展[J].化学生物与工程,2007,24(4):15-16.

[2]张朕华,谢炜,吉蕊,等.甘露聚糖肽对恶性实体肿瘤支持治疗的临床循证研究[J].中国医院药学杂志,2012,32(1):35-40.

[3]梁良,陈琳,王晓珊.甘露聚糖肽和地榆升白片对放射治疗中白细胞减少症的临床评价[J].中国医药导刊,2013,15(8):1439-1441.

[4]苏巧俐,刘峰,王多宁.甘露聚糖肽对反复呼吸道感染的临床疗效和免疫功能影响的系统评价[J].中国循证医学杂志,2014,14(6):759-764.

[5]张萍,王剑虹,陈晓航,等.lH-NMR用于肺炎链球菌荚膜多糖质量控制的尝试[J].微生物学免疫学进展,2009,37(3):11-15.

[6]王玺,任克明,陈晓航,等.核磁共振波谱法在肺炎球菌荚膜多糖检定中的应用[J].微生物学免疫学进展,2013,41 (3):18-23.

[7]The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopoeia[M].Rockville:The United States Pharmacopeial Convention,2013:335-342,1068-1119.

[8]European Pharmacopoeia Commission.European Pharma-copeia[M].8th ed.Strasbourg:European Directorate for the Quality of Medicines and Health Care of the Council of Europe,2013:52-55,109.

[9]The British Pharmacopoeia Commission.British Pharma-copoeia [M].2013 ed.London:The Stationary Office,AppendixⅡC Nuclear Magnetic Resonance Spectro-metry,2013.

[10]National Pharmacopoeia Committee.The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China [M].PartⅡ,2010 ed.Beijing:China Medical Science Press,2010:81-83.

[11]World Health Organization.Recommendations to assure the quality,safety and efficacy of pneumococcal conjugate vaccines[R].[s.l.]:[s.n.],2010:927.

[12]CHITRANANDA A,THOMAS C,WILLIAMS J,etal.Development and validation of an NMR-based identity assay for bacterial polysaccharides[J].Analytical Biochemistry,2000,279:226-240.

[13]苗爱东,孙殿甲.Excel 2002在中药指纹谱相似度计算中的应用[J].药学进展,2003,27(1):51-54.

[14]LI Si,PAN Chen,XIA Wei,etal.Structural characterization of the polysaccharide moiety of an aqueous glycopeptide from mannatide[J].International Journal of Biological Macro-molecules,2014,67(6):351-359.

[15]高照明,张玉冰.1H-NMR分析肝素钠中杂质多硫酸软骨素[J].波谱学杂志,2011,28(2):278-289.

[16]张雪梅,张玲,高飞虎,等.魔芋葡甘露聚糖的结构及改性研究进展[J].南方农业,2014,8(16):41-42.

[17]菅红磊,张卫明,蒋建新,等.半乳甘露聚糖胶酶法改性研究进展[J].中国野生植物资源,2009,28(2):5-12.

Identification of Mannatide by1H-NMR

XIA Wei1,SHEN Yan-hong1,FU Di1,ZHANG Wen-qing1,WAN Yan-fei2,ZHANG Li2

(1.Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Chengdu Lier Pharmaceutical Co.Ltd,Chengdu 610083,China)

1H-NMR method was established for identification of mannatide:A portion of the anomeric region of each spectrum (δ4.89～5.90) was selected as the “fingerprint” identification region.The tested samples spectra were compared with the standard reference spectrum of mannatide,using correlation coefficient to calculate the similarity.The specificity,repeatability and precision of this method were investigated.There was no significant difference between the tested samples spectra and reference spectrum,and the similarity was greater than 0.95.Methodological evaluation showed the specificity of1H-NMR identification method was satisfactory.The1H-NMR method established in this assay was simple,reproducible and specific,which was suitable for identification of mannatide.

1H-NMR; mannatide; identification

1006-3080(2016)04-0508-05

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.04.011

2015-12-17

夏玮(1976-),女,江苏盐城人,副教授,博士,研究方向为天然产物的分离与分析。E-mail:xiawei1999@ecust.edu.cn

通信联系人：张文清,E-mail:zhwqing @ecust.edu.cn

R927.11

A