新疆不同地区生产的葡萄酒中八种生物胺含量的测定

邓玉杰，马雪蕾，张凯婷，王　瑞，武　运，张珍珍

新疆不同地区生产的葡萄酒中八种生物胺含量的测定

邓玉杰，马雪蕾，张凯婷，王瑞，武运，张珍珍*

（新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）技术，以丹磺酰氯作为柱前衍生试剂，测定了新疆不同地区21个市售葡萄酒中的8种生物胺含量。结果表明，不同地区葡萄酒中的生物胺总含量存在明显差异，和田地区葡萄酒中总生物胺含量最少，为37.16 mg/L，吐鲁番地区葡萄酒中生物胺总含量最高，为335.18 mg/L，且不同地区生产的葡萄酒中各项生物胺种类也存在差异，生物胺中含量最高的是精胺，平均测定含量为87.37 mg/L。通过对葡萄酒中生物胺含量的测定分析，可以为新疆地区葡萄酒中的生物胺的安全品质控制提供依据。

葡萄酒；不同地区；生物胺；测定

葡萄酒是用破碎或未破碎的新鲜葡萄果实或葡萄汁为原料经完全或者部分酒精发酵后获得酒精度不低于7%vol的发酵型酒精饮料［1］。葡萄酒中富含很多种类的氨基酸，它们在乳酸菌产生的脱羧酶作用下从而生成组胺、精胺、腐胺、尸胺及苯乙胺等多种生物胺，其中葡萄酒中主要的生物胺为精胺、组胺以及腐胺，甲胺、乙胺、尸胺、苯乙胺和异戊胺等胺类物质存在于发酵前的葡萄原汁中，但是酵母菌等某些微生物在发酵过程之中可以把一部分的生物胺降解［2］；当葡萄酒酒精发酵时期处在以酵母菌为主导时，含量最高的即为酿酒酵母菌株体内的胍基丁胺和乙醇胺，在葡萄酒苹果酸乳酸发酵时期，酪胺、组胺、腐胺等生物胺是乳酸菌将氨基酸脱羧而成［3］，除此之外，还含有尸胺及苯乙胺等其他种类的生物胺存在于苹果酸乳酸发酵后的葡萄酒中。在对葡萄酒中发酵过程的生物胺的含量测定结果表明，在酒精发酵过后葡萄酒中的生物胺含量很低，但在经苹果酸-乳酸发酵后，葡萄酒中生物胺的含量发生不同程度的增高［4-5］。

生物胺具有特定的生物活性［6］，是杂环类或一类脂肪族的低分子质量含氮碱，在动植物和微生物生理活性细胞中尤为重要，且适量有助于人体正常的生理功能，过量则会对机体的生理产生一定的不良反应，存在致癌风险［7］。除此之外，构成核酸及荷尔蒙等的前体物质也是生物胺，并且生物活性细胞不可或缺的组成部分其中就是腐胺、精胺、亚精胺和尸胺，它们不仅可以调节核酸与蛋白质的合成，在生物膜稳定性方面同样也发挥着重要作用［8］，而且一些致癌物质和亚硝基化合物的前体生成物质也是生物胺。大多数食物中的生物胺可能对人的机体有一定的不良影响，如芳香族生物胺（酪胺和苯乙胺等），可引起偏头痛和高血压［9-10］，其中组胺为危害性最大的生物胺，许多国家已经作出了葡萄酒中组胺的限量范围。澳大利亚、匈牙利和瑞士规定≤10mg/L，法国规定≤8mg/L，荷兰规定≤3.5 mg/L，比利时规定≤5～6 mg/L，德国规定≤2 mg/L。目前，其检测和分析方法包括生物传感器、薄层色谱（thin-layerchromatography，TCL）、毛细管电泳（capillaryelectrophore-sis，CE）和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法，其中HPLC具有分析速度快、柱效高、检测灵敏度高、定量分析准确的特点，是目前食品中生物胺含量分析测定的主要手段［11］。

本实验主要采用反相高效液相色谱法（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）测定新疆不同区域和类型的葡萄酒中生物胺种类及含量，获得新疆产区葡萄酒中生物胺种类及含量普查数据，以期为葡萄酒中生物胺的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

不同地区的干红葡萄酒：市售；乙腈（色谱纯）：美国Fisher公司；组胺、酪胺、尸胺、乙胺、苯乙胺、精胺、亚精胺、腐胺和丹磺酰氯：美国Sigma公司。

1.2仪器与设备

1200Series高效液相色谱仪（紫外检测器）：美国Agient公司；D2155W离心机、MS 3涡旋混匀器：美国Merck公司；DHG-9053A恒温培养箱：上海鸿都电子科技有限公司；FA2004分析天平：上海天平仪器厂。

1.3试验方法

1.3.1生物胺标准储备溶液的配制

分别称取生物胺各10 mg，用0.l mg/L HC1溶液溶解并转移到10 mL容量瓶中，用0.l mg/L的HC1溶液定容，作为标准贮备液，4℃冰箱保存备用。使用前，根据实验需要将此标准贮备液用0.1 mg/L HC1溶液配成质量浓度为100 mg/L的标准工作液，4℃冰箱保存备用。

1.3.2生物胺标准混合溶液的配制

分别吸取1.00 mL各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个10 mL容量瓶中，用0.1 mg/L盐酸稀释至刻度，混匀，配制成生物胺标准混合使用液（100 mg/L）。

1.3.3生物胺标准系列溶液配制

吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL生物胺标准混合使用液（100 mg/L），分别置于10 mL容量瓶中，用0.10 mg/L盐酸溶液稀释至刻度，混匀，使其质量浓度分别为1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0mg/L、50.0 mg/L。

1.3.4样品前处理和衍生

试样提取：取葡萄酒10mL向其加入0.2mL（100 mg/L）的内标使用液，再向其中加入NaCl至饱和，移取饱和后的试样提取液5 mL，置于15 mL离心管中，后用0.1 mg/L的NaOH将其pH值调节为12，萃取时用5mL正丁醇-氯仿（1∶1，V/V）的溶液提取，再进行旋涡振动5 min，以3 600 r/min的速度再进行10 min的离心。吸取上层有机相后再用等体积的萃取液进行2次提取，合并萃取液后混匀，取3 mL萃取液，加入0.2 mL 1 mg/L盐酸，混合后40℃水浴条件下用氮气吹干，再加入1 mL 0.1 mg/L盐酸溶解残留物，待衍生。

取0.5 mL样品提取液，置10 mL具塞试管中，加入1.5 mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0 mL（5 mg mL丙酮）衍生剂，混合振荡。置60℃条件下反应30 min（中间振荡两次），取出后加入100 μL谷氨酸钠（50 mg/L饱和碳酸氢钠溶液），振荡，60℃条件下保温15 min。取出每个试管中加入1 mL超纯水，40℃水浴下，用氮气除去丙酮。加入3 mL乙醚，旋涡振荡器上混合振荡2 min，静置，分层后取上层有机相（乙醚层），加重复萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃水浴条件下氮气吹干。加1.0 mL甲醇溶解残留物，振荡混合，过0.22 μm（0.45 μm）微孔滤膜，滤液可直接进HPLC测定。

1.3.5高效液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温：30℃，紫外检测波长为254 nm，A相为甲醇，B相为超纯水进行梯度洗脱，流速：1.5 mL/min，进样量为20 μL，以峰面积内标法定量，梯度洗脱条件见表1。

表1　梯度洗脱条件Table 1 Conditions of gradient elution

2　结果与分析

2.1生物胺标准样品及样品的测定

由于分子中缺少发色基团，既无荧光和电化学活性，本身又无紫外吸收，所以只能检测到衍生后的生物胺。丹磺酰氯作为比较稳定的衍生物，同时具有特异的紫外吸收和荧光响应，而且采用其衍生获得的检测结果较为理想［12］。生物胺标准品及葡萄酒样品的高效液相色谱图如图1所示。

由图1A可知，8种生物胺混标组分在30 min内得到了一个很好的分离效果，其出峰顺序为精胺4.50 min，色胺14.84 min，苯乙胺17.83 min，腐胺20.41 min，尸胺22.74min，组胺25.68min，酪胺27.69min，亚精胺28.36 min。由图1B可知，葡萄酒样品中生物胺组分出峰顺序为精胺4.50 min，色胺13.80 min，苯乙胺18.09 min，腐胺20.42 min，尸胺22.82 min，组胺25.71 min，酪胺27.69 min，亚精胺28.36 min。

图1　8种生物胺标准品（A）及葡萄酒样品（B）的高效液相检测色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of eight biogenic amines standard substance（A）and wine sample（B）

2.2不同地区葡萄酒中生物胺总量的测定

分别吸取上述标准系列和试样的衍生溶液注入高效液相色谱仪中，测定，记录色谱图，计算各生物胺和内标的峰面积比，以标准系列溶液的质量浓度为纵坐标，以各生物胺和内标的峰面积比为横坐标，绘制标准曲线，按照标准曲线回归方程再计算试样中的生物胺含量，结果如图2所示。

图2　新疆不同地区葡萄酒中生物胺总含量Fig.2 Total contents of biogenic amines in wine from Xinjiang different regions

由图2可知，不同地区葡萄酒中生物胺含量存在明显差异，样品葡萄酒中生物胺含量在37～327 mg/L范围，伊犁不同地区总生物胺含量相对均匀，吐鲁番地区的总生物胺含量相比其他地区较高，昌吉两地的生物胺含量相差较大，其他地区总生物胺含量也存在明显差异，说明生物胺的生成是一个复杂的过程，在葡萄酒的发酵过程中与酵母菌及乳酸菌的作用有很大关系且葡萄酒中氨基酸含量、发酵工艺以及发酵车间卫生条件等都影响着葡萄酒中氨基酸向生物胺及高级醇的转化，葡萄酒在酿造时加入氨基酸的也会影响生物胺的生成。

2.3各地区不同生物胺组分含量的测定

新疆不同地区葡萄酒中精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、组胺、色胺、腐胺含量测定结果如图3所示。

图3　新疆不同地区葡萄酒中各生物胺组分含量Fig.3 Component contents of biogenic amines in Xinjiang different regions

由图3可知，新疆不同地区葡萄酒中精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、组胺、色胺、腐胺都有检出，并且有所差异。葡萄酒中组胺含量波动范围在2.00～9.74 mg/L，其中大部分地区组胺含量在平均值4.19 mg/L左右，其中伊犁-2和吐鲁番-4号样品中含量偏高。精胺含量波动范围在28.63～218.38 mg/L，相比其他生物胺，精胺在葡萄酒样品中的含量最高，说明精胺是葡萄酒发酵后的主要生物胺，其前体物质是精氨酸［13-16］。亚精胺波动范围在0.88～4.17 mg/L，其中最高和最低的两地区亚精胺含量相差3.29 mg/L，由于亚精胺含量不高，且各地区相差也不是很大，说明现有的亚精胺控制技术已经很成熟。酪胺波动范围在1.71～7.24 mg/L，酪胺含量除个别地区高于平均值外，其他地区酪胺含量在3.00 mg/L左右。苯乙胺含量波动范围0.69～4.50 mg/L，吐鲁番地区苯乙胺的含量相对较均匀，阜康和哈密地区的苯乙胺含量存在明显差异，可能是加工过程中某些工艺或处理不相同造成的。尸胺除了阜-1没有检出外，其他地区都有检出，其含量波动范围在0.02～2.32mg/L，相比其他生物胺而言，尸胺是葡萄酒样品中含量是最少的生物胺。色胺含量波动范围在0.41～6.14 mg/L，其中玛纳斯地区的色胺含量远远高于其他地区的。腐胺含量波动范围在0.07～83.13 mg/L，其波动范围比较大，说明腐胺是可以在生产过程中加以控制并减少的生物胺。

3　结论

本实验按照国标GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的测定》中方法测定了20个地区市售葡萄酒中的生物胺含量，发现不同产区的总生物胺存在明显差异，即使是同一产区葡萄酒中生物胺含量也可能存在较大的差异，说明在酿酒过程中生物胺的产生很复杂的，同时发现一些产区中的生物胺含量较低，说明可以对葡萄酒的一些生产工艺加以调控，来减少葡萄酒中的生物胺含量，以此来降低生物胺对人体的危害。

［1］熊正河.中国葡萄酒标准制定与实施［J］.中国卫生标准管理，2011，2（6）：42-47.

［2］张春晖，夏双梅，张军翔.葡萄酒中的生物胺的生产与工艺控制［J］.食品科学，2002，23（10）：128-130.

［3］孔维府，范春艳，张翛翰，等.论葡萄酒中生物胺生成的影响因素及其检测方法［J］.中国酿造，2010，29（6）：13-16.

［4］SOUFLEROS E，BARRIOS M L，BERTRAND A.Correlation between the content of biogenic amines and other wine compounds［J］.Am J Enol Viticult，1998，49（3）：266-278.

［5］李志军，吴永宁，薛长湖.生物胺与食品安全［J］.食品与发酵工业，2004，30（10）：84-91

［6］刘景，任婧，孙克杰.食品中生物胺的安全性研究进展［J］.食品科学，2013，34（5）：322-326.

［7］LAURA M，NATALIJA N.Histamine and histamine intolerance［J］.Clin Nutr，2007，85（5）：1185-1196.

［8］李志军，吴永宁，薛长湖.生物胺与食品安全［J］.食品与发酵工业，2004，30（10）：84-91.

［9］RUSSO P，SPANO G，ARENA M P，et al.Are consumers aware of the risks related to biogenic amines in food［C］//Current Research，Technologyand Education Topicsin Applied Microbiologyand Microbial Biotechnology，Spain：Microbiology Series，2010：1087-1095.

［10］栾同青.黄酒酿造过程生物胺变化规律及其产生菌株研究［D］.济南：齐鲁工业大学，2013.

［11］范春艳，孔维府，潘秋红，等.葡萄酒中8种生物胺的RP-HPLC检测方法的研究［J］.中国酿造，2010，29（3）：168-171.

［12］沈念原，王秀芹.高效液相色谱法测定葡萄酒中生物胺的含量［J］.食品工业科技，2011，32（4）：394-396.

［13］李志军.食品中生物胺及其产生菌株检测方法研究［D］.青岛：中国海洋大学，2007.

［14］李华，梁新红，郭安鹊.葡萄酒苹果酸-乳酸菌精氨酸代谢研究概况［J］.微生物学报，2006，46（4）：663-667.

［15］LONVAUD F A.Biogenic amines in wines：role of lactic acid bacteria［J］.FEMS Microbiol Lett，2001，199（11）：9-13.

［16］LEHTONEN P.Determination of amines and amino acids in wine-a review［J］.Am J Enol Viticult，1996，47（2）：127-133.

Determination of eight kinds of biogenic amines content in wine from Xinjiang different regions

DENG Yujie，MA Xuelei，ZHANG Kaiting，WANG Rui，WU Yun，ZHANG Zhenzhen*
（College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830000，China）

Using dansyl chloride as pre-column derivation agents，eight kinds of biogenic amines content in wine from 21 regions in Xinjiang was determined by reverse phase high phase liquid chromatography（RP-HPLC）.The results showed that the total content of biogenic amines in wine from differentregionswassignificantdifference.Thetotalcontentofbiogenicaminesin wine fromHotan region wasthe least（37.16 mg/L），and the totalcontent of biogenic amines in wine from Turpan region was the highest（335.18 mg/L）.The types of biogenic amines in wine from different regions were also difference.Spermine content was the highest in biogenic amines，and the average content was 87.37 mg/L.By determination and analysis of biogenic amines content，it could provide the basis for safety and quality of biogenic amines in wine of Xinjiang regions.

wine；different region；biogenic amines；determination

N34

0254-5071（2016）07-0171-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.037

2016-04-06

新疆维吾尔自治区高校科研计划项目（XJEDU2014S019）；国家大学生创新创业训练计划项目（201510758006）

邓玉杰（1991-），女，本科生，研究方向为食品质量与安全。

张珍珍（1984-），女，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。