柑橘皮渣液态发酵制取曲酸工艺优化

王淑培，吴玉财，兰美香，史昌蓉，张　静

柑橘皮渣液态发酵制取曲酸工艺优化

王淑培1，吴玉财1，兰美香1，史昌蓉2，张静1

（1.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300；2.广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）

以柑橘皮渣为原料，接种米曲霉，以液态摇瓶发酵的形式进行曲酸生产的研究。采用Box-Behnken中心组合设计，通过响应面法优化柑橘皮渣发酵的最佳工艺。结果表明，最佳发酵参数为米曲霉接种量4%、柑橘皮渣添加量13 g/100 mL、酵母膏添加量1.5 g/100 mL、MgSO4·7H2O添加量0.05 g/100 mL，在此条件下发酵制得的曲酸质量浓度最高，为（11.84±1.44）mg/mL。

柑橘皮渣；米曲霉；曲酸；响应面法

曲酸（kojic acid）是由黄曲霉、米曲霉和寄生曲霉等微生物好氧发酵所产生的一种弱酸性的次生代谢产物，化学名称为5-羟基-2-羟甲基-1，4-比喃酮，分子式为C6H6O4，常存在于以食品发酵行业中曲霉为菌种的发酵产品中［1-3］。曲酸具有较强的抗氧化、清除自由基、抑菌、螯合金属离子、抑制酪氨酸酶活性、增强巨噬细胞的活性等能力，常作为生物防腐剂、护色剂和发色剂、保鲜剂、护肤美白剂、作物生长促进剂、杀虫剂、摄影材料护胶乳液、胶片祛斑剂等［4-11］，广泛应用应用于食品、化妆品、医药行业、农业生产等领域。柑橘皮渣为柑橘加工的主要副产物，其组成为柑橘皮（60%～65%）、残余果肉（30%～35%）、种子（0～10%），富含果胶、纤维素、木质素、香精油色素及多种矿物质元素，是一种良好的微生物生长基质［12-13］。目前，对柑橘皮渣的资源化利用主要集中在提取精油、色素、果胶等生物活性成分［14-15］，生产乙醇、甲烷等生物燃料［16-17］，堆肥生产有机肥［18］，发酵生产饲料［19］、制取酶制剂、食品添加剂等方面［20］。随着柑橘加工业的逐渐发展，柑橘皮渣综合处理问题日益突出。目前主要的处理方式是卫生填埋，但在降低柑橘生产效率的同时也会造成二次污染［21］。因此探索柑橘皮渣的利用途径具有非常重要的现实意义。本试验以柑橘皮渣为原料，探索发酵制备曲酸的工艺条件。为柑橘皮渣的综合利用提供新的途径，也扩展了曲酸生产的新方法。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

米曲霉（Aspergillus oryzas）GIM3.423：广州微生物研究所微生物菌种保藏中心。

柑橘皮渣：柑橘取皮榨汁取渣后置于40℃干燥箱中烘干，粉粹过60目筛密封保存备用。

酵母膏、蛋白胨（均为生化试剂），吐温-80（化学纯），蔗糖、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化铁（均为分析纯）：上海展云化工有限公司。

菌种活化和孢子培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基；

种子培养基：葡萄糖10g/100 mL、酵母膏0.6 g/100 mL、KH2PO40.5 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL、吐温-80 0.01 g/100 mL、KCl 0.05 g/100 mL、pH 6.0，121℃湿热灭菌15 min；

发酵培养基：柑橘皮渣13g/100mL、酵母膏1.5g/100mL、KH2PO40.1 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL、KCl 0.05 g/100 mL、pH 6.0。

1.2仪器与设备

UV-3200S紫外分光光度计：上海美普达仪器有限公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHP-9082电热恒温培养箱：上海慧泰仪器制造有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台：苏州净化设备有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；SHZ-82气浴恒温振荡器：常州国华电器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌种培养

在超净工作台上，将装有米曲霉GIM3.423菌种的安瓿管开启后，将无菌玻璃棒伸入安瓿管内蘸取少量粉末于装有少量无菌生理盐水的试管中，微振荡使粉末分散，在PDA培养皿上斜面划线培养，置于25～28℃培养箱中培养24 h，为第一代菌种。第一代菌株用灭菌的生理盐水冲洗在无菌培养皿上，涂布棒灼烧冷却后蘸在倒好的PDA平板上涂布，25～28℃培养箱培养4 d，为第二代菌种。

1.3.2孢子悬液的制备

用灭好菌的生理盐水（含有0.01%吐温-80）将培养好的第二代菌种冲洗下来，制成3×106个/mL的孢子悬液，4℃冰箱保存备用。

1.3.3种子培养

按4%的接种量将计数的孢子悬液接种到种子培养基（100 mL/250 mL）中，30℃、200 r/min摇瓶培养6 h。

1.3.4液态发酵培养

将培养好的种子培养液按一定接种量接种于灭菌好的发酵培养液（100 mL/250 mL）中，在30℃、200 r/min摇瓶培养13 d，检测曲酸的质量浓度。

1.3.5优化培养基的试验设计

（1）单因素试验设计

采用液态发酵的方式，选择柑橘皮渣添加量、接种量、酵母膏添加量、MgSO4·7H2O添加量这4个工艺参数进行单因素试验［22］。各因素的水平设置分别为：柑橘皮渣添加量为9 g/100 mL、10 g/100 mL、11 g/100 mL、12 g/100 mL、13 g/100 mL、14 g/100 mL，接种量为2%、4%、6%、8%、10%（V/V），酵母膏添加量为0.9 g/100 mL、1.2 g/100 mL、1.5 g/100 mL、1.8 g/100 mL、2.1 g/100 mL，MgSO4·7H2O添加量为0.025 g/100 mL、0.050 g/100 mL、0.075 g/100 mL、0.100 g/100 mL、0.125 g/100 mL。在不同水平条件下发酵培养后，测定发酵液中曲酸的质量浓度。

（2）响应面试验设计

以发酵液中曲酸质量浓度为考察指标，根据单因素的试验结果，以接种量（A）、酵母膏添加量（B）、柑橘皮渣量（C）为影响因子，采用Design Expert 8.05b软件进行设计与分析，通过响应面法优化柑橘皮渣液态发酵制取曲酸的工艺。响应曲面方案设计的因素与水平见表1。

表1　柑橘皮渣液态发酵制取曲酸工艺参数优化响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for citrus pomace liquid-state fermentation process optimization for kojic acid production

1.3.6测定方法

曲酸质量浓度的测定：采用三氯化铁比色法［23］。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1柑橘皮渣添加量对曲酸发酵的影响

图1　柑橘皮渣添加量对曲酸发酵的影响Fig.1 Effect of citrus pomace contents on kojic acid production

从图1可以看出，随着柑橘皮渣添加量的增加发酵液中曲酸质量浓度也随之增加，在柑橘皮渣添加量为13 g/100 mL时曲酸质量浓度最高。原因在于柑橘皮渣量增加，其中的碳源含量增高，有助于米曲霉生长、发酵，曲酸质量浓度随之增高。但依据试验发酵方式为液态发酵，当柑橘皮渣添加量为14 g/100 mL时培养基较为黏稠，培养基接近为半固体。综合考虑，选择柑橘皮渣添加量为13 g/100 mL进行后续试验。

2.1.2接种量对曲酸发酵的影响

从图2可以看出，随着接种量的增加，发酵液中的曲酸质量浓度也增高，在接种量为4%时曲酸质量浓度达到最高，随后逐渐降低。因为米曲霉分裂生长在一定空间里是会受到限制的，当分裂到一定程度时便会饱和，此时菌株对菌株相互抑制生长，发酵受到限制，曲酸质量浓度反而缓慢降低。因此选择接种量为4%进行后续试验。

图2　接种量对曲酸发酵的影响Fig.2 Effect of inoculum on kojic acid production

2.1.3酵母膏添加量对曲酸发酵的影响

图3　酵母膏添加量对曲酸发酵的影响Fig.3 Effect of yeast extract concentration on kojic acid production

从图3可以看出，随着酵母膏添加量的增加曲酸质量浓度变化较为缓慢。在酵母膏添加量为1.5 g/100 mL时曲酸质量浓度达到最大值，酵母膏添加量继续增高，曲酸质量浓度略有下降。因此选择酵母膏添加量为1.5 g/100 mL进行后续试验。

2.2.4 MgSO4·7H2O添加量对曲酸发酵的影响

图4　MgSO4·7H2O添加量对曲酸发酵的影响Fig.4 Effect of MgSO4·7H2O concentration on kojic acid production

从图4可以看出，MgSO4·7H2O添加量对曲酸发酵的影响非常微小，在MgSO4·7H2O添加量为0.05 g/100 mL时曲酸质量浓度最高。因此综合考虑，选择MgSO4·7H2O添加量为0.05 g/100 mL进行后续试验。

2.3响应面试验结果

2.3.1响应面试验设计及结果

结合单因素试验结果，以曲酸质量浓度（Y）为响应值，以接种量（A）、酵母膏添加量（B）、柑橘皮渣添加量（C）为响应因子，采用Box-Behnken试验设计3因素3水平的响应面分析试验，试验设计及结果如表2所示。

表2　柑橘皮渣液态发酵制取曲酸工艺参数优化响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments for citrus pomace liquid-state fermentation process optimization for kojic acid production

利用Design Expert 8.05b分析软件对实验数据进行回归分析，可得到二次多项式回归方程：Y=144.80-3.00A-7.50B+14.50C-3.00AB+11.00AC-14.00BC-9.40A2-36.40B2-28.40C2。对模型进行显著性检验，结果如表3所示。

表3　回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

由表3可知，数学模型P＜0.000 1，说明该模型显著；失拟项不显著（P=0.455 3＞0.05），表明回归方程具有显著意义。模型的决定系数R2=0.944 1，调整后决定系数R2Adj为0.986 6，说明方程能解释98.66%的响应值变化。变异系数0.41%，说明该数学模型对试验拟合较好，试验误差小，可以用来预测试验结果。二次项A2、B2、C2对响应值曲线效应影响极显著，交互项AB对响应值曲面效应影响不显著，交互项AC和BC影响极显著；3个因素对曲酸得率影响的顺序为：C＞B＞A，即柑橘皮渣添加量＞酵母膏添加量＞接种量。

2.3.2响应面分析

各因素的交互作用对曲酸质量浓度的影响如图5所示。

图5　接种量、酵母膏质量浓度、柑橘皮渣质量浓度交互作用对曲酸质量浓度影响的响应曲面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，yeast extract addition，citrus pomace addition on kojic acid production

从图5可以较为直观地看出，各因素对发酵产曲酸质量浓度的影响。随着接种量、酵母膏添加量和柑橘皮渣添加量的增加，曲酸的含量呈现先增高后下降的趋势，在所选取的数值内均存在极值。沿酵母膏添加量（B）方向比接种量（A）的响应面坡度的坡度更陡，等高线更为密集，说明酵母膏的添加量对曲酸产量的影响大于接种量；等高线呈扁平状表示两因素交互影响较大。与方差分析的结果相一致；柑橘皮渣添加量（C）对曲酸质量浓度的影响大于接种量（A），且两因素的交互作用明显；柑橘皮渣添加量（C）对曲酸的影响大于酵母膏添加量（B）的影响，两者交互作用明显，符合方差分析的结果。

2.3.3验证试验结果

通过Design Expert 8.05b分析得到模型的极大值点为：接种量3.65%、酵母膏添加量1.45 g/100 mL、柑橘皮渣添加量13.23 g/100 mL，预测得到最高曲酸质量浓度为11.31 mg/mL。考虑实际操作性，选取米曲霉的接种量为4%，酵母膏添加量1.5g/100mL，柑橘皮渣添加量13g/100mL进行验证试验，平行发酵5组，测得曲酸的质量浓度为（11.84± 1.44）mg/mL。曲酸实际值与预测值吻合度较高，因此响应面优化得到的发酵参数能够较为准确地预测实际产曲酸情况。

3　结论

本研究探索柑橘皮渣液态摇瓶发酵制取曲酸的工艺，为柑橘皮渣的综合利用提供新的途径。采用单因素试验和响应面法对发酵工艺进行优化。单因素结果显示，接种量、酵母膏量、柑橘皮渣量对曲酸质量浓度影响较大，且接种量为4%、酵母膏添加量为1.5 g/100 mL、柑橘皮渣添加量为13 g/100 mL，MgSO4·7H2O添加量为0.05 g/100 mL时曲酸质量浓度最高。在此基础上，采用Box-Behnken试验设计及响应面法分析，进一步优化发酵参数，得到了各因素对提取量影响的二次回归模型。方差分析显示所建模型回归效果极显著，拟合度良好。3个因素对曲酸质量浓度影响均显著，且影响顺序为柑橘皮渣添加量＞酵母膏添加量＞接种量。优化所得最佳工艺参数为米曲霉的接种量为4%，酵母膏添加量1.5 g/100 mL，柑橘皮渣添加量13 g/100 mL，MgSO4·7H2O添加量为0.05 g/100 mL，在此条件下，发酵产曲酸质量浓度为（11.84±1.44）mg/mL。

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Optimization of liquid-state fermentation process of kojic acid by citrus pomace

WANG Shupei1，WU Yucai1，LAN Meixiang1，SHI Changrong2，ZHANG Jing1
（1.College of Tea and Food Science，Wuyi University，Wuyishan 354300，China；2.College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

Using citrus pomace as raw material andAspergillus oryzaeas fermentation starter，kojic acid was produced by liquid-state shake flask fermentation.Using Box-Behnken centrol composite design，the optimal fermentation process of citrus pomace was optimized by response surface methodology.As a result，the optimal fermentation parameters were determined as follows：A.oryzaeinoculum 4%，citrus pomace 13 g/100 ml，yeast extract 1.5 g/100 ml，and MgSO4·7H2O 0.05 g/100 ml.Under the conditions，the kojic acid production was the highest of（11.84±1.44）mg/ml.

citrus omace；Aspergillus oryzae；kojic acid；response surface methodology

TS209

0254-5071（2016）07-0108-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.023

2016-03-21

福建省“大学生创新创业训练计划”项目（201410397041）作者简介：王淑培（1986-），女，助教，硕士，研究方向为食品科学。