紫色红曲霉FBKL3.0018液态发酵产酯化酶的研究

任佳明，李付丽，吴鑫颖，邱树毅，周罗娜

紫色红曲霉FBKL3.0018液态发酵产酯化酶的研究

任佳明1，2，李付丽1，2，吴鑫颖1，2*，邱树毅1，2，周罗娜1，2

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点试验室，贵州 贵阳 5500251；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

以从中温大曲中筛选获得的紫色红曲霉FBKL3.0018为研究对象，并对该菌株液态发酵产酯化酶工艺条件进行优化。通过单因素试验、正交试验确定此菌株优化后的液态发酵的最佳培养基组成为5%麦芽糖、2%牛肉膏、0.04%硫酸镁，最高酶活力达到116.32 U/mL，较培养基优化前提高45%；最佳培养条件为接种量10%、培养温度32℃、培养时间5 d、摇床转速160 r/min，最高酶活力达到153.34 U/mL，较培养条件优化前提高32%。

紫色红曲霉；酯化酶；液态发酵；工艺优化

酯化酶又称酯酶，其功能与脂肪酶相似，都能催化酯键的水解和合成。酯化酶常用于传统食品的微生物发酵生产及食品风味的改良等方面，其中尤以白酒酿造过程中的应用研究最多。在白酒酿造中，酯化酶增香技术常用来合成己酸乙酯为主的香味成分，在生产中用于调整传统生产工艺和调味酒的生产［1］。酯是构成白酒香味的主要成分之一，是在白酒酿造过程中由产酯化酶的微生物产生。所以，从白酒生产中筛选高产酯化酶的微生物并强化其产酯效果，对白酒尤其是浓香型白酒的增香提质具有非常重要的意义。

目前常见的产酯化酶菌株是根霉、红曲霉及酵母［2-5］。VANOT G等［6］对圆弧青霉（Penicillium cyclopium）产脂肪酶的3个主要因素（玉米浆浓度、pH和接种量）进行了考察和优化，获得了较好的优化结果。ABDEL-FATTAHYR等［7］研究了橄榄油、pH、吐温-80和培养温度对土芽孢杆菌属（Geobacillussp.）产嗜热脂肪酶的影响，优化后酶活力比原始培养条件有很大提高。BURKERT J F M等［8］研究了葡萄糖、玉米浆、NH4NO3和油脂对Geobacillussp.产脂肪酶的影响，也取得了很好的结果。

本研究从浓香型白酒酿造的中温大曲中筛选出一株高产酯化酶的菌株（紫色红曲霉FBKL3.0018），以此菌株为研究对象，进行液态发酵培养，通过单因素及正交试验优化其产酶条件。为下一步酯化酶催化合成酯以及白酒酿造过程中产香菌株的强化，浓香型白酒生产过程中产酯产香和黄水的回收利用等方面奠定良好的研究基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

紫色红曲霉FBKL3.0018：贵州省发酵工程与生物制药重点试验室筛选并保藏。

菌种保藏培养基（麦芽汁琼脂培养基）：麦芽膏粉13%，琼脂1.5%，氯霉素0.01%，pH 6.0；种子培养基：葡萄糖5%，蛋白胨1.5%，NaNO30.2%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 5.5；基础发酵培养基：葡萄糖5%，蛋白胨2%，NaNO30.2%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 5.5。

硝酸钠、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、醋酸-α-萘酯、α-萘酚聚乙烯醇、固兰B盐、体积分数95%乙醇、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、尿素、硫酸亚铁、氯化钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

UV2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；MJX-250B-Z霉菌培养箱、BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JJ-CJ-1FD洁净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；DK-98-11电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；XW-80A旋涡混合仪：海门市杜琪贝尔仪器制造有限公司；BCD-215DK冰箱：青岛海尔股份有限公司。

1.3试验方法

1.3.1粗酶液的制备

试管斜面活化培养：取1环紫色红曲霉FBKL3.0018接种于麦芽汁琼脂斜面，32℃恒温培养6 d。

孢子悬浮液制备：向活化菌种的斜面中加入15 mL无菌水，用接种环轻轻刮洗，倒入已灭菌装有玻璃珠的三角瓶中，用玻璃珠将孢子充分打散，制成106～107个/mL的孢子悬浮液，备用。

摇瓶培养：按8%的接种量在装有50 mL培养基（种子培养基∶基础发酵培养基=1∶1）的250 mL三角瓶中接入孢子悬浮液，32℃、150 r/min条件下培养72 h。

粗酶液的制备：培养结束后，用4层纱布过滤分离菌丝体和发酵液，滤液在4℃、3 500 r/min条件下离心15 min，收集上清液，获得粗酶液。

1.3.2培养基优化

碳源种类对产酶的影响：分别用5%葡萄糖（对照）、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖作为基础发酵培养基中的碳源，其他成分不变，按照1.3.1的方法进行培养，考察碳源种类对菌株酯化酶活力的影响。

碳源含量对产酶的影响：分别调节基础发酵培养基中的碳源含量为3%、5%、7%、9%、11%，其他成分不变，按照1.3.1的方法进行培养，考察碳源含量对菌株酯化酶活力的影响。

氮源种类对产酶的影响：分别用2%蛋白胨（对照）、酵母粉、牛肉膏、尿素、硝酸铵、硫酸铵作为基础发酵培养基中的氮源，其他成分不变，按照1.3.1的方法进行培养，考察氮源种类对菌株酯化酶活力的影响。

氮源含量对产酶的影响：分别调节基础发酵培养基中的氮源含量为2%、4%、6%、8%、10%，其他成分不变，按照1.3.1的方法进行培养，考察氮源含量对菌株酯化酶活力的影响。

硫酸镁含量对产酶的影响：分别调节基础发酵培养基中的硫酸镁含量为0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，其他成分不变，按照1.3.1的方法进行培养，考察硫酸镁含量对菌株酯化酶活力的影响。

在单因素研究基础上，选择麦芽糖含量、牛肉膏含量、硫酸镁含量3个因素，以酯化酶活力为考察指标设计3因素3水平正交试验。正交试验因素与水平见表1。

表1　培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for culture medium formula optimization

1.3.3培养条件优化

接种量的确定：选择5%、10%、15%、20%的接种量，在32℃、160 r/min的条件下进行液体摇瓶培养3 d，考察接种量对菌株酯化酶活力的影响。

温度的确定：文献报道的紫色红曲霉产酶最佳范围温度多为25～37℃，本试验选择26℃、29℃、32℃、35℃的不同培养温度，在接种量为10%、160 r/min的条件下进行液体摇瓶培养3 d，考察温度对菌株酯化酶活力的影响。

转速的确定：选择120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min的摇床转速，在32℃、接种量为10%的条件下进行液体摇瓶培养3 d，考察转速对菌株酯化酶活力的影响。

培养时间的确定：选择培养时间为1 d、3 d、5 d、7 d，在32℃、160 r/min、接种量为10%的条件下进行液体摇瓶培养，考察培养时间对菌株酯化酶活力的影响。

在单因素研究基础上，选择接种量、温度、摇床转速、培养时间4个因素，以酯化酶活力为考察指标，设计4因素3水平正交试验。正交试验因素与水平见表2。

表2　培养条件优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for culture conditions optimization

1.3.4酶活力测定

酶活的定义：40℃条件下反应5 min，单位酯化酶每分钟水解α-乙酸萘酯产生1.0 μmolα-萘酚，定义为1个酶活力单位（U/mL）。

酶活的测定方法：按照参考文献［9］的方法进行。

2　结果与分析

2.1培养基优化

2.1.1碳源种类对酯化酶活力的影响

图1　碳源种类对酯化酶活力的影响Fig.1 Effect of carbon sources type on esterification enzyme activity

从图1可以看出，在5种碳源中，紫色红曲霉在以麦芽糖为碳源的培养基中产酯化酶的酶活力最高，其次是葡萄糖和淀粉，乳糖最低，这与参考文献［10-16］中红曲霉喜麦芽糖的结论相符。因此选择麦芽糖为基础发酵培养基的碳源进行后续试验。

2.1.2麦芽糖含量对酯化酶活力的影响

图2　麦芽糖含量对酯化酶活力的影响Fig.2 Effect of maltose contents on esterification enzyme activity

从图2可以看出，紫色红曲霉在麦芽糖含量为5%的培养基中产酯化酶的酶活力最高，当碳源浓度继续升高时，酯化酶活力反而大幅度下降。说明碳源浓度过大，易产生抑制效应，抑制酯化酶的合成。适宜的碳源浓度利于微生物的生长和产酶，碳源供应不足时，影响菌体生长速度，并在培养后期易引起菌体衰老和自溶，对酶合成不利。因此选择麦芽糖含量为5%进行后续试验。

2.1.3氮源种类对酯化酶活力的影响

从图3可以看出，在5种氮源中，紫色红曲霉在以牛肉膏为氮源的培养基中产酯化酶的酶活力最高，其次是硫酸铵，其他几种氮源的效果相差不大。这可能是因为牛肉膏含有有利于菌体生长的生长因子，可促进菌体生长和产酶。因此选择牛肉膏作为基础发酵培养基的氮源进行后续试验。

图3　氮源种类对酯化酶活力的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources type on esterification enzyme activity

2.1.4牛肉膏含量对酯化酶活力的影响

图4　牛肉膏含量对酯化酶活力的影响Fig.4 Effect of beef extract contents on esterification enzyme activity

从图4可以看出，紫色红曲霉在牛肉膏含量为2%的培养基中产酯化酶的酶活力最高。氮源浓度过高导致微生物生长过于旺盛，造成不合适的碳氮比，不利于产酶，氮源浓度过低，不利于微生物的生长繁殖。因此选择牛肉膏含量为2%进行后续试验。

2.1.5硫酸镁含量对酯化酶活力的影响

图5　硫酸镁含量对酯化酶活力的影响Fig.5 Effect of MgSO4contents on esterification enzyme activity

从图5可以看出，当硫酸镁含量为0.05%时，紫色红曲霉产酯化酶酶活力最高，随着硫酸镁的含量增高，酯化酶酶活力略有所降低，但均高于不添加硫酸镁时的产酶量。因此选择硫酸镁含量为0.05%进行后续试验。

2.1.6培养基优化正交试验

表3　培养基配方优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

由表3可以得出，该紫色红曲霉菌株液态发酵培养基组成为A2B2C1，即麦芽糖含量5%，牛肉膏含量2%，硫酸镁含量0.04%。该试验组在正交表中未出现，所以进行验证试验。其平均酯化酶酶活力为116.32 U/mL，比培养基优化前的酶活力提高45%。

2.2培养条件优化

2.2.1接种量对酯化酶活力的影响

图6　接种量对酯化酶活力的影响Fig.6 Effect of inoculum on esterification enzyme activity

从图6可以看出，当紫色红曲霉接种量为10%时，酯化酶酶活力最高。如果接种量过低，菌株易老化，影响产酶；但接种量过高，会造成营养物质消耗过快，菌丝结团过多影响溶氧等，也会影响其产酶能力。合适的接种量有利于孢子的萌发，菌丝体的生长，营养物质的合理利用及产物的积累。故选择10%的接种量为较佳接种量。

2.2.2培养温度对酯化酶活力的影响

图7　培养温度对酯化酶活力的影响Fig.7 Effect of culture temperature on esterification enzyme activity

从图7可以看出，培养温度较低时，紫色红曲霉生长速度缓慢，酯化酶酶活力较小；当培养温度为29℃时，酯化酶酶活力最高；随着培养温度继续提高，酶活力逐渐减小。故选择29℃为较佳培养温度。

2.2.3摇床转速对酯化酶活力的影响

图8　摇床转速对酯化酶活力的影响Fig.8 Effect of shaker speed on esterification enzyme activity

从图8可以看出，随着摇床转速的增大，紫色红曲霉产酯化酶的酶活力先增加后降低。当摇床转速为160 r/min时，酯化酶活力最高。一方面，转速的大小决定了培养液中菌丝球所受机械力的大小；另一方面，转速与培养体系的溶氧状况有关，适宜的溶氧浓度有利于菌株生长代谢。当培养液中溶氧量不能满足菌体要求时，则会使代谢途径的方向受到影响，影响产物的正常合成。故选择160 r/min为较佳摇床转速。

2.2.4培养时间对酯化酶活力的影响

图9　培养时间对酯化酶活力的影响Fig.9 Effect of culture time on esterification enzyme activity

从图9可以看出，随着培养时间的延长，紫色红曲霉产酯化酶的酶活力逐渐增大。培养1 d时，酶活较低，这是因为发酵前期，孢子萌发，菌丝体形成，生长速度较慢，则产酶较少。随着培养时间的延长，酶活逐渐增大。当培养到第5 d时，酯化酶酶活力达到最大，为120 U/mL。当继续延长培养时间，酯化酶活力稍有下降趋势，这是由于随着发酵液中营养物质的消耗，菌体衰老甚至自溶，进而影响产酶。故选择5 d为较佳培养时间。

2.2.5培养条件优化正交试验

表4　培养条件优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

由表6可以得出，该紫色红曲霉菌株最优液态发酵培养条件为A2B3C2D2，即接种量10%，培养温度32℃，摇床转速160 r/min，培养时间为5 d。由于最优试验组合未在表中出现，因此进行验证试验，其平均酯化酶酶活力为153.34 U/mL，比培养条件优化前酶活力提高了32%。

3　结论

对紫色红曲霉菌株FBKL3.0018进行液态发酵产酯化酶条件的优化。结果得出该紫色红曲霉菌株液态发酵培养基组成为麦芽糖5%，牛肉膏2%，硫酸镁0.05%，酶活力达到116.32 U/mL，较培养基优化前提高了45%；该紫色红曲霉菌株最优液态发酵培养条件为接种量10%，培养温度32℃，摇床转速160r/min，培养时间为5d，酶活力达到153.34U/mL，较培养条件优化前提高32%。

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Esterification enzyme production by submerged fermentation fromMonmascus purpureusFBKL3.0018

REN Jiaming1，2，LI Fuli1，2，WU Xinying1，2*，QIU Shuyi1，2，ZHOU Luona1，2
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using theMonascus purpureusFBKL3.0018 screened from medium temperature Daqu as research object，the esterification enzyme-producing technology conditions of submerged fermentation were optimized.By single factor experiments and orthogonal experiments，the optimum components of culture medium were determined as maltose 5%，beef extract 2%and MgSO40.04%，and the highest enzyme activity was up to 116.32 U/ml，which was 45%higher than that of before optimization.The optimum culture conditions were inoculum 10%，culture temperature 32℃，time 5 d and shaker speed 160 r/min，and the highest enzyme activity was up to 153.34 U/ml，which was 32%higher than that of before optimization.

Monascus purpureus；esterification enzyme；submerged fermentation；technology optimization

TQ920.6

0254-5071（2016）07-0069-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.015

2016-02-20

黔科合LH字［2014］7675

任佳明（1992-），男，硕士研究生，研究方向为酶工程。

吴鑫颖（1975-），女，副教授，硕士，研究方向为酶工程。