纳豆固态发酵工艺优化

黄　婷，刘良忠，曹宇翔，贾维宝（武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

纳豆固态发酵工艺优化

黄婷，刘良忠*，曹宇翔，贾维宝
（武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

为了得到高品质的纳豆，以优质黄豆为原料，采用纳豆激酶含量和黏液产率为评价指标，研究初始含水量、接种量、发酵温度、发酵时间对纳豆激酶含量和黏液产率的影响。根据单因素试验结果，对纳豆固体发酵工艺进行正交旋转组合设计的优化，得到纳豆固体发酵工艺的最佳参数为初始含水量为51%，接种量为0.15%，发酵温度为43℃，发酵时间为24 h，该条件下纳豆激酶含量为0.076mg/m L，黏液产率为17.60%。

纳豆；纳豆激酶含量；黏液产率

纳豆是以黄豆为主要原料，蒸煮后接入纳豆菌（枯草杆菌）发酵而成的具有独特风味的一种食品。具有抗血栓降血压抗肿瘤等多种生理功能［1］，经常食用可预防或治疗多种亚健康体质长期积累引起的疾病［2］。SUM IH等［3］在1987年从纳豆中提取出一种具有溶栓功能的物质并将其命名为纳豆激酶（nattokinase，NK），纳豆激酶属于纳豆枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，体内体外试验都已证明具有高效的溶栓活性［4-5］，其不仅可以直接溶解交联状的血栓，而且可以催化血纤维蛋白原转化成有活性的血纤维蛋白原溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成，增强体内血栓的溶解活性［6］。纳豆激酶是一种安全的理想的预防和治疗栓塞的生化药物［7］。因此食用纳豆制品、纳豆激酶产品可以达到预防和治疗血栓类疾病的目的。

1　材料与方法

1.1料与试剂

黄豆：市售；纳豆菌：试验室自制；硫酸铵：天津市致远化学试剂有限公司。

1.2器与设备

BXM-30R高压灭菌锅、GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；AR214O Adventure电子分析天平：美国Ohaus公司；GNP-9160隔水式恒温培养箱：上海精宏试验设备有限公司；TGL205冷冻离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；PHS-3C pH计：上海精密科学仪器有限公司；7200型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3法

1.3.1备工艺流程

黄豆→浸泡→蒸煮→接种→发酵→后熟

称取适量的黄豆清洗干净，加入黄豆质量4倍的水，在40℃水浴锅中保温2.5 h，加入3%豆质量的食盐，121℃高压灭菌锅蒸煮20m in，冷却后加入0.1%纳豆菌，42℃发酵22 h，转入4℃冰箱后熟18 h。

1.3.2酶液制备

将发酵完成的纳豆，按1∶4（g∶m L）的比例用0.9%无菌生理盐水于摇床分两次浸提1 h，合并提取液，10 000 r/m in冷冻离心10min，上清液即为纳豆激酶粗酶液［8］。

1.3.3析法分离纯化纳豆激酶

将研细的（NH4）2SO4按照20%的饱和度加入到上述上清液中，4℃保存过夜，10 000 r/min离心30min，弃去沉淀（沉淀为初步分离的杂蛋白），取上清液加入硫酸铵至60%饱和度，4℃保存过夜后10 000 r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用10mmol/L的磷酸缓冲液溶解［9］。

1.3.4因素试验

初始含水量的确定：在蒸煮时间20min，接种量0.1%，发酵温度42℃，发酵时间22 h的条件下，选择大豆初始含水量分别为40%、45%、50%、55%、60%，以纳豆激酶含量和黏液产率为评价指标，确定最佳初始含水量。

接种量的确定：在初始含水量50%，蒸煮时间20min，发酵温度42℃，发酵时间22 h的条件下，选择接种量分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，以纳豆激酶含量和黏液产率为评价指标，确定最佳接种量。

发酵温度的确定：在初始含水量50%，蒸煮时间20min，接种量0.1%，发酵时间22 h的条件下，选择发酵温度分别为34℃、38℃、42℃、46℃、50℃，以纳豆激酶含量和黏液产率为评价指标，确定最佳发酵温度。

发酵时间的确定：在定初始含水量50%，蒸煮时间20min，接种量0.1%，发酵温度42℃的条件下，选择发酵时间分别为18 h、20 h、22 h、24 h、26 h，以纳豆激酶含量和黏液产率为评价指标，确定最佳发酵时间。

1.3.5因子（1/2实施）二次回归正交旋转设计优化纳豆固态发酵工艺

在单因素的基础上，以纳豆激酶含量、黏液产率为指标，采用四因子二次正交旋转设计，取3次平行测量的平均值，利用Excel软件进行回归分析。试验的因素水平编码见表1。

表1　纳豆固态发酵工艺优化二次回归正交旋转设计因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal rotation combination design for natto solid-sta te ferm entation technology optim ization

1.3.6测方法

纳豆黏液产率：准确称取5.000 0 g纳豆2份，一份直接在105℃烘箱中烘至质量恒定，另一份用温水轻轻地洗掉纳豆表面的黏液，再移入烘箱中烘至质量恒定［10］。

式中：W1为直接烘干至质量恒定的纳豆质量，g；W2为水洗后烘干至质量恒定的纳豆质量，g。

纳豆激酶含量：取1m L样品液，加入5m L考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀后放置5min，在紫外-可见分光光度计波长595 nm处测定吸光度值。根据牛血清蛋白标准曲线回归方程A=0.009 1C+0.010 9（相关系数R2=0.992 2），计算样品液中纳豆激酶含量［11］。

2　结果与分析

2.1始含水量对NK含量及黏液产率的影响

图1　大豆初始含水量对NK含量及黏液产率的影响Fig.1 Effecto f initialwater contentof soybean on NK content and mucus yield

由图1可知，大豆初始含水量为40%～50%时，随着初始含水量的增加，纳豆激酶含量和黏液产率不断升高。随后随着含水量增加，纳豆激酶含量和黏液产率不断下降。可能原因是纳豆发酵过程中，大豆中的含水量主要影响营养基质的溶解是否完全和传递是否均匀，从而影响产酶量。当大豆初始含水量为40%～50%时含水量少，则随着发酵的进行，物料水分的蒸发，菌体不能很好地生长和积累产物［12］；初始含水量为50%～60%时，由于大豆吸水膨胀，使菌体得不到良好的氧气供应，发酵结束后观察到的培养皿底部有乳白色的液体，将菌丝浸泡，致使菌丝不能生长，进而影响到纳豆激酶的产量［13］。大豆初始含水量为50%时纳豆激酶含量和黏液产率达到最大值，此时纳豆激酶含量为0.075mg/m L，黏液产率为14.45%。因此，选择大豆初始含水量为50%。

2.2种量对NK含量及黏液产率的影响

图2　接种量对NK含量及黏液产率的影响Fig.2 Effectof inoculum on NK contentand mucus yield

由图2可知，纳豆激酶含量和黏液产率在接种量0.10%时达到最大值，此时纳豆激酶含量为0.075mg/m L，黏液产率为9.11%，此后随着接种量的增加，纳豆激酶含量和黏液产率逐渐降低。接种量过大，微生物可能会因为生长过于旺盛而营养物质过快消耗，并且氧气量不足，从而不利于菌体生长以及酶的合成；接种量小，不能使菌液均匀的分布到大豆表面，难以实现发酵完全，不利于目标产物的积累［14］。因此，选择0.10%为最佳接种量。

2.3酵温度对NK含量及黏液产率的影响

图3　发酵温度对NK含量及黏液产率的影响Fig.3 Effectof fermentation tem perature on NK contentand mucus yield

由图3可知，随着发酵温度的增大纳豆激酶含量和黏液产率先增大后减小，在发酵温度为42℃时达到最大值，纳豆激酶含量为0.062mg/m L，黏液产率为15.78%。纳豆呈黄褐色，黏液呈乳白色，且纳豆黏液黏稠度较好，拉丝不易断裂［15］。发酵温度在34～42℃时，随着温度的升高，反应速度增大，细胞生长旺盛；当温度＞42℃时，由于温度过高使得细胞内部的酶促反应所需的酶的酶活降低，并且纳豆发酵时中心的温度会更高，发酵产热的速率过快使得热量无法散出，从而使得环境不利于菌体的生长，使其生长速率过快或过慢，发酵不均匀或者副产物增多，进一步影响纳豆激酶的酶活，而且高温会使纳豆激酶部分失活。因此，选择42℃为最佳发酵温度。

2.4酵时间对NK含量及黏液产率的影响

图4　发酵时间对NK含量及黏液产率的影响Fig.4 Effectof fermentation time on NK contentand mucus yield

由图4可知，发酵时间为18～22 h时，纳豆激酶含量和黏液产率随着发酵时间的延长逐渐增加，到22 h时达到最大值，此时纳豆激酶含量为0.072mg/m L，黏液产率为10.97%；超过22 h之后，纳豆激酶含量和黏液产率逐渐减少，可能是由于发酵时间过长而导致有害产物的积累，纳豆激酶产量下降［7］。因此，选择22 h为最佳发酵时间。

2.5豆固态发酵工艺优化二次回归正交旋转设计

试验以纳豆激酶含量为指标，利用Excel对其进行回归分析及方差分析，结果见表2。

表2　纳豆固态发酵工艺优化二次回归正交旋转设计结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal rotation combination design for natto solid-state ferm entation technology optim ization

表3　以NK含量为评价指标的方差分析Table 3 Analysis of variance w ith NK content as evalua tion index

以纳豆激酶含量为响应值，进行回归拟合，由表4得到回归方程为：Y=-1.643 3+0.027 8X1+0.035 2X2+0.045 7X3+0.001 1X4-0.000 3X12-0.000 5X32。由表3知P＜0.01，表明回归方程非常显著有意义。由表4知因素的主次顺序是：X3＞X1＞X4＞X2，即发酵温度＞初始含水量＞发酵时间＞接种量。

表4　以NK含量为评价指标的回归分析Table 4 Analysis of regression with NK content as eva luation index

表5　以黏液产率为评价指标的方差分析Table 5 Analysis of variance w ithmucus yield as evaluation index

表6　以黏液产率为评价指标的回归分析Table 6 Analysis of regression w ith m ucus yield as evaluation index

以黏液产率为响应值，进行回归拟合，由表6得到回归方程为：Y=-351.593+6.729 9X1+12.554 9X2+8.862 1X3+ 0.403 6X4-0.028 9X1X3-0.054 3X12-0.087 7X32。由表5知P＜0.01，表明回归方程非常显著有意义。由表5知因素的主次顺序是：X3＞X1＞X4＞X2，即发酵温度＞初始含水量＞发酵时间＞接种量。

在两个回归方程的基础上分别进行规划求解，保证一定黏液产率的基础上，尽量增加纳豆激酶产量，经过规划求解，得到最佳纳豆激酶发酵工艺为初始含水量为51.42%，接种量为0.15%，发酵温度为42.61℃，发酵时间为24h，纳豆激酶含量为0.078mg/m L，黏液产率为17.66%。考虑实际操作条件，修改纳豆激酶发酵工艺为初始含水量为51%，接种量为0.15%，发酵温度为43℃，发酵时间为24 h，在此条件下，进行验证试验，纳豆激酶含量达到了0.076mg/m L，黏液产率为17.60%，和预测值基本相吻合，说明该模型具有较好的预测性。

3　结论

通过试验得到纳豆固体发酵工艺的最佳参数为初始含水量为51%，接种量为0.15%，发酵温度为43℃，发酵时间为24h，该条件下纳豆激酶含量为0.076mg/m L，黏液产率为17.60%。

［1］MUROOKA Y，YAMSHITA M.Traditional healthful fermented productsof Japan［J］.J Ind M icrobiol Biotechnol，2008（35）:795-796.

［2］代增英，冯建岭，李迎秋，等.纳豆及纳豆激酶的研究进展［J］.山东食品发酵，2013（1）：46-50.

［3］SUM IH，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese Natto:A typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia，1987，43（10）:1110-1111.

［4］FUJITA M，HONG K，ITO Y，etal.Transportof nattokinase across the rat intestinal tract［J］.Biol Pharm Bull，1995，18（9）:1194-1196.

［5］SUM IH，HAMADA H，NAKANISHIK，etal.Enhancementof the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase［J］.Acta Haematol，1990，84（3）:139-143.

［6］FUJITA M，NOMURA K，HONG K，etal.Purification and characterization of astrong fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan［J］.Biochem Biophys Res Comm，1993，197（3）:1340-1347.

［7］李永飞，王正刚，卢泽民，等.固体发酵纳豆激酶培养基的优化［J］.粮食加工，2008，33（1）：58-60.

［8］张莉.纳豆加工工艺的研究和产品开发［D］.济南：山东轻工业学院硕士论文，2012.

［9］高大海.纳豆激酶的分离纯化和酶学性质研究［D］.杭州：浙江大学硕士论文，2005.

［10］高泽鑫，王常苏，黄勋，等.双菌混合发酵生产豆豉的条件优化［J］.中国酿造，2014，33（9）：49-52.

［11］Bradford M M.A rapid and sensitivemethod for the quantitation ofmicrogramquantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72（1）:248-254.

［12］郭海勇，王波，乔继伟，等.纳豆激酶固体发酵条件优化［J］.吉林师范大学学报，2008，5（2）：66-68.

［13］王刚.纳豆激酶的固体发酵、分离纯化及应用研究［D］.长春：吉林农业大学硕士论文，2005.

［14］苏雪燕.纳豆激酶分离、纯化及其酶学性质研究［D］.济宁：曲阜师范大学硕士论文，2013.

［15］祖国仁，孔繁东，刘阳，等.纳豆菌固体发酵条件及产品成分分析［J］.食品工业科技，2006，27（12）：122-124.

Optimization of solid-state fermentation technology ofnatto

HUANG Ting，LIU Liangzhong*，CAO Yuxian，JIAWeibao
（College ofFood Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

In order to obtain high quality natto，using the superior quality soybean as raw material and natto kinase contentand mucus yield asevaluation index，the effects of initialwater content，inoculum，fermentation tem perature，time on natto kinase content and mucus yield were researched. According to the resultsof single factor experiments，natto solid-state fermentation technologywasoptimized by orthogonal rotation combination design.The optimum parameters of natto solid-state fermentation technology were initialwater content 51%，inoculum 0.15%，fermentation temperature43℃，time24 h.Under the conditions，natto kinase contentandmucusyieldwere0.076mg/m land 17.60%，respectively.

natto；nattokinase content；mucusyield

TS214．2

0254-5071（2016）01-0141-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．031

2015-11-06

黄婷（1990-），女，硕士研究生，研究方向为新资源开发与利用。

刘良忠（1963-），男，教授，博士，研究方向为新资源开发与利用。