滇黄芩总黄酮酶解超声提取工艺及抗氧化活性研究

刘海鸥，虎春艳，赵声兰，普春霞，刘晓玲，林玉萍（云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500）

滇黄芩总黄酮酶解超声提取工艺及抗氧化活性研究

刘海鸥，虎春艳，赵声兰，普春霞，刘晓玲，林玉萍*
（云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500）

该文研究了滇黄芩总黄酮酶解超声提取的工艺条件及总黄酮的抗氧化活性。结果表明，纤维素酶解超声工艺对滇黄芩总黄酮的提取具有协同作用，提高总黄酮提取得率。在超声功率100W条件下，通过单因素和正交试验，得出酶解超声最佳工艺条件为提取时间4 h、乙醇体积分数55%、加酶量50U/g（干原料）、液料比30∶1（m L∶g）、提取温度50℃，在此条件下，平均提取得率为24.03%。抗氧化实验研究表明，滇黄芩总黄酮对超氧阴离子和羟自由基的清除率IC50分别为0.14mg/m L、0.20mg/m L。

纤维素酶；超声；滇黄芩总黄酮；得率；抗氧化活性

滇黄芩（Scutellaria amoena C.H.W right）是云南道地中药材，地方本草《滇南本草》（明朝）记载其“味苦，性寒，上行泻肺火，下降泻膀胱火”。滇黄芩为多年生草本，生于向阳坡草地、石隙或杂草丛中［1］。

滇黄芩是我国西南地区药用黄芩的主流品种，具有较高的利用价值。现代研究表明，黄芩主要含有黄酮类成分及挥发油类、萜类、甾醇类等成分［2］；具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节脂代谢、抗肿瘤、保护心血管系统等作用［3-6］。滇黄芩与黄芩相似，主要含有黄酮类化合物。目前对黄酮类化合物的提取方法有水提、醇提、酶解等提取方法［7］。据文献报道纤维素酶可以提高药材有效成分的溶出率［8］，魏凤玉等［9］研究发现乙醇和纤维素酶提取黄芩中总黄酮类成分具有协同作用，王新等［10］用超声-酶解法提取麦麸总黄酮成分时同样具有协同作用。为了进一步提高滇黄芩中总黄酮的提取得率，缩短提取时间，用纤维素酶-乙醇-超声提取，通过单因素和正交试验得到滇黄芩中总黄酮的最佳提取工艺条件，并对滇黄芩总黄酮进行了抗氧化活性研究。本研究为滇黄芩总黄酮的提取及其抗氧化活性提供了理论依据，有利于滇黄芩的进一步开发利用。

1　材料与方法

1.1料与试剂

滇黄芩样品：采自云南玉溪新平；黄芩苷标准品、纤维素酶（酶活力35U/mg）：中国药品生物制品检定所；邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻二氮菲、硫酸亚铁、浓盐酸、双氧水、无水乙醇、浓硫酸均为国产分析纯：汕头市达濠精细化学品有限公司。

1.2器与设备

H.H.S11-4电热恒温水浴锅：国华电器有限公司；SK 2200H超声仪：上海科导超声仪器有限公司；电子天平：美国KUDOS公司；UV 759S紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3方法

1.3.1芩苷标准曲线的测定

取黄芩苷标准品溶液在波长200～400 nm处紫外扫描，结果在波长278 nm有最大吸收，即λmax=278 nm。精密称取黄芩苷对照品7.1mg，置于25m L容量瓶，用70%乙醇水溶液定容，摇匀，分别取0、0.5m L、1.0m L、1.5m L、2.0m L、2.5m L、3.0m L于25m L容量瓶，用无水乙醇定容至刻度。用紫外分光光度计测其在波长278 nm处的吸光度值（A），以吸光度值A对黄芩苷标准品含量（C）进行线性回归，得回归方程A=63.248C-0.010 8（R2=0.999 8）。

1.3.2黄酮提取方法及提取得率计算

精确称取3.0 g干燥的滇黄芩粉末，加入60m L一定体积分数的乙醇溶液，另加纤维素酶，一定温度水浴，超声功率100W条件下回流提取，抽滤，滤液置于沸水浴中3min，冷却至室温，用无水乙醇定容至100m L，稀释后测波长278 nm处的吸光度值。总黄酮得率计算公式如下：

式中：η为总黄酮提取得率，%；C为滇黄芩总黄酮溶液的质量浓度，mg/m L；V为滤液体积，mL；m为滇黄芩粉末质量，g。

1.3.3黄酮提取工艺条件优化

（1）单因素试验

提取时间对总黄酮得率的影响：选取提取温度50℃，液料比20∶1（m L∶g），乙醇体积分数50%，加酶量50 U/g（干原料），控制提取时间分别为2 h、3 h、4 h、5 h、6 h进行提取，计算总黄酮的得率，分析提取时间对总黄酮得率的影响。

乙醇体积分数对总黄酮得率的影响：确定提取时间5 h，温度50℃，液料比20∶1（m L∶g），加酶量50U/g，控制乙醇体积分数分别为20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%，计算总黄酮的得率，分析乙醇体积分数对总黄酮提取得率的影响。

料液比对总黄酮提取得率的影响：确定乙醇体积分数50%，提取时间5 h，温度50℃，加酶量50U/g，控制料液比分别为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1（m L∶g），计算总黄酮的得率，分析液料比对总黄酮提取得率的影响。

加酶量比对总黄酮提取得率的影响：确定液料比30∶1（m L∶g），乙醇体积分数50%，提取时间5 h，温度50℃，控制加酶量分别为30 U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g，计算总黄酮的得率，分析加酶量对总黄酮提取得率的影响。

温度对总黄酮提取得率的影响：确定加酶量50 U/g，液料比30∶1（m L∶g），乙醇体积分数50%，提取时间5 h，控制温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，计算总黄酮的得率，分析温度对总黄酮提取得率的影响。

（2）正交试验

为确定最佳工艺条件，根据单因素试验结果，在温度50℃条件下，以总黄酮提取得率为评价指标，选取L9（34）正交表对滇黄芩总黄酮提取得率进行研究，正交试验因素与水平见表1。

表1　总黄酮提取得率优化正交试验因素与水平Table 1 Factor and levels of orthogonalexperiments for total flavonoid extraction yield optimization

1.3.4黄酮体外抗氧化活性研究

称取滇黄芩300 g，按照上述工艺条件进行提取得到滇黄芩粗提取物，按照文献条件［11］，利用AB-8型大孔树脂纯化得滇黄芩总黄酮。

（1）清除超氧阴离子（O2-·）活性测定［12］

采用邻苯三酚自氧化法，取10m L具塞试管，依次加入0.1mol/L pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液4.5m L，蒸馏水4.2m L，摇匀，25℃恒温水浴20m in，取出后立即加入25℃预热3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 m L，迅速混匀，在波长319 nm处每隔30 s测一次吸光度值，计算邻苯三酚的自氧化速率△A对照，按上法在加入邻苯三酚前，先加入滇黄芩总黄酮溶液，测定△A样品。超氧自由基清除率计算公式如下：

式中：△A对照为1min内对照管吸光度的变化值；△A样品为1m in内对照管吸光度的变化值。

（2）清除羟自由基（·OH）的活性测定［13］

采用H2O2/Fe体系法，利用邻二氮菲与Fe2+反应生成配合物，该配合物在波长536 nm处有最大吸收。当有羟自由基（·OH）存在的情况下，Fe2+会被氧化成Fe3+，从而降低产物在波长536 nm处的吸光度值。待测样品如果对羟自由基具有清除作用，会抑制A536nm的减少。取10m L具塞试管，以维生素C（vitamicC，VC）为阳性对照，分别依次加入滇黄芩总黄酮溶液或等浓度VC溶液1m L，0.75mmol/L FeSO4溶液1m L，0.75mmol/L邻二氮菲1m L，0.01%H2O2溶液1m L，37℃保温1 h，测定吸光度值A。损伤管和未损伤管不加抑制剂，损伤管含1m LH2O2，未损伤管不加H2O2。羟基自由基清除率计算公式如下：

式中：A0为未损伤管的吸光度值；A1为损伤管的吸光度值；A2为样品未损伤管的吸光度值；A3为样品损伤管的吸光度值。

2　结果与分析

2.1黄酮提取工艺条件的优选

2.1.1因素试验

（1）提取时间对总黄酮提取得率的影响

图1　提取时间对提取得率的影响Fig.1 Effectof extraction time on extraction yield

提取时间对总黄酮提取得率的影响结果见图1。由图1可知，滇黄芩总黄酮的提取得率在2～4h内随着提取时间的延长，总黄酮提取得率急剧升高；4～5h总黄酮的提取得率趋于稳定；超过5h，提取得率微微下降。由于黄酮类成分具有酚羟基，长时间提取结构容易发生改变，故提取时间5h为宜。

（2）乙醇体积分数对总黄酮提取得率的影响

图2　不同乙醇体积分数对提取得率的影响Fig.2 Effecto f ethano lcontenton extraction yie ld

乙醇体积分数对总黄酮提取得率的影响结果见图2。由图2可知，乙醇体积分数在35%～60%时总黄酮的提取得率较高，是由于乙醇和酶具有协同作用破坏细胞壁，提高总黄酮的溶出率；当乙醇体积分数＞60%时，脂溶性杂质溶出率增高，并对酶的活性产生抑制作用，导致总黄酮溶出率反而减低。故乙醇体积分数选择45%为宜。

（3）不同液料比对总黄酮提取得率的影响

图3　不同液料比对提取得率的影响Fig.3 Effecto f liquid-to-solid ratio on extraction yield

料液比对总黄酮提取得率结果的影响见图3。由图3可知，随着液料比的增大，提取得率增加，当料液比超过30∶1（m L∶g）后，提取得率趋于稳定。溶剂增多可加大浓度差，有利于有效成分的溶出，但杂质的溶出率也会增加，从经济学角度考虑，液料比以30∶1（m L∶g）为宜。

（4）加酶量对总黄酮提取得率的影响

图4　加酶量对提取得率的影响Fig.4 Effectof enzyme addition on extraction yield

加酶量对总黄酮提取得率的影响见图4。从图4可知，纤维素酶量在30～50U/g间时，提取得率增加，纤维素酶量超过50U/g以后，提取得率趋于稳定，则选取纤维素酶添加量为50U/g。

（5）提取温度对总黄酮提取得率的影响

图5　不同温度对提取得率的影响Fig.5 Effectof extraction tem perature on extraction ratio

温度对总黄酮提取得率的影响见图5。由图5可知，当温度在30～50℃时，提取率随着温度的升高而增加，超过50℃后，提取率呈下降趋势。温度的升高有利于有效成分的溶出，但过高的温度会抑制纤维素酶的活性，也会导致黄酮类成分分解，故温度以50℃为宜。

2.2交试验

为确定最佳工艺条件，根据单因素试验结果，因温度对总黄酮提取影响不显著，故固定温度50℃条件下，选取L9（34）正交表对滇黄芩总黄酮提取进行研究，重复试验3次。正交试验设计方案及结果见表3，方差分析见表4。

表3　总黄酮提取率优化正交试验结果与分析Tab le 3 Results and analysis of orthogonalexperiments for total flavonoid extraction yield optim ization

表4　正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonalexperiments results

正交试验结果表明，最佳试验方案为A1B3C3D2，即提取时间4 h，乙醇体积分数55%，加酶量60U/g，液料比30∶1（m L∶g）。方差分析表明，提取时间、乙醇体积分数、纤维素酶添加量以及液料比对滇黄芩总黄酮的提取率均有显著影响（P＜0.05）。按照此试验方案，重复3次，总黄酮提取得率分别为24.27%、23.68%、24.13%，平均提取得率为24.03%。

2.3黄酮体外抗氧化活性

2.3.1超氧阴离子的清除作用

图6　滇黄芩总黄酮对超氧阴离子的清除率Fig.6 Superoxide anion scavenging activity o f total flavones from Scute llaria amoena

滇黄芩总黄酮对超氧阴离子的清除结果见图6。由图6可知，低质量浓度的滇黄芩总黄酮对超氧阴离子的清除效果接近于VC，当质量浓度＞0.25mg/m L时清除率超过了VC。滇黄芩总黄酮清除超氧阴离子的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为0.14mg/m L，表明高质量浓度的滇黄芩总黄酮对超氧阴离子具有较强的清除作用。

2.3.2羟自由基（·OH）的清除作用

图7　滇黄芩总黄酮对除羟自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging ac tivity of to tal flavones from Scute llaria am oena

滇黄芩总黄酮对除羟自由基的清除效果见图7，由图7可以看出，滇黄芩总黄酮对羟自由基具有明显的清除作用，当质量浓度＞0.2mg/m L时，清除作用超过了同浓度的维生素C，滇黄芩总黄酮清除羟自由基IC50为0.200 1mg/m L，表明滇黄芩总黄酮对羟自由基具有较强的清除作用。

3　结论

研究表明，纤维素酶超声提取法能有效破解药材细胞的细胞壁，有利于成分的溶出［13］，对滇黄芩中总黄酮的提取具有协同作用，能有效提高滇黄芩中总黄酮的提取得率。在超声功率100W条件下，通过单因素试验和正交试验得到滇黄芩总黄酮的最佳提取工艺条件，即提取时间4 h，乙醇体积分数55%，加酶量60U/g，液料比30∶1（m L∶g）。在此最佳条件下，总黄酮得率达到24.03%。纯化后的滇黄芩总黄酮对超氧自由基和羟自由基均具有有较强的的清除作用，具有良好的抗氧化活性，对滇黄芩资源的利用开发具有一定意义。

［1］李娅琼，游春，杨耀文，等.民族药滇黄芩的本草考证李娅琼［J］.云南中医学院学报，2005，28（1）：13-15，21.

［2］王雅芳，李婷，唐正海，等.中药黄芩的化学成分及药理研究进展［J］.中华中医药学刊，2015，33（1）：206-211.

［3］TAKAHASHIH，CHEN M C，PHAM H，etal.Baicalein a componentof Scutellaria baicalensis，induces apoptosis by M cl-1 down-regulation in human pancreatic cancer cells［J］.BBA-M ol Cell Biol L，2011，13（8）: 1465-1474.

［4］WAISUNDARA V Y，SIU SY，etal.Baicalin upregulates thegenetic expression of antioxidant enzymes in Type-2 diabetic Goto-Kakizaki rate［J］.Life Sci，2011，88（23-24）:16-25.

［5］DU G J，HAN G，ZHANG S，et al.Baicalin suppresses lung carcinoma and lung metastasis by SOD mimic and HIF-1αinhibition［J］.Eur J Pharm Biopharm，2010，630（1-3）:1-30.

［6］何晓山，彭林，林青.滇黄芩总黄酮对豚鼠心肌细胞电压依赖性钠通道电流的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：192-195.

［7］黄贤荣，于燕莉，董淑荣.国内常用的黄芩有效成分提取分离方法简介［J］.实用医药杂志，2012，29（3）：267-269.

［8］喻春皓，张萍，王宏志.正交试验优选蒸制黄芩的纤维素酶辅助提取工艺［J］.中国药房，2009，20（36）：2826-2827.

［9］魏凤玉，王欣纤.维素酶-乙醇协同提取黄芩总黄酮［J］.天然产物研究与开发，2014，26（4）：575-578.

［10］王新，肖凯军.纤维素酶-超声辅助提取麦麸总黄酮的工艺研究［J］.食品科技，2009，34（12）：230-234.

［11］吕子明，李志宏，梁俊清，等.大孔吸附树脂纯化黄芩总黄酮工艺研究［J］.中国医药导报，2012，9（10）：143-145.

［12］梁杏，张旭，陈朝银，等.核桃饼粕多酚纯化工艺及其抗氧化活性的研究［J］.中国酿造，2015，34（4）：55-61.

［13］虎春艳，林玉萍，鲁瑞，等.紫色胡萝卜汁体外抗氧化活性的研究［J］.中国酿造，2015，34（1）：85-88.

［14］伏慧慧，谭梅，郭艳秋.响应面法优化“酶法-超声波”连续提取核桃青皮多酚［J］.食品研究与开发，2015，36（7）：42-47.

［15］李小龙，雍其欢，崔秋兵.纤维素酶-超声波辅助提取泡姜姜辣素的研究［J］.中国酿造，2015，34（6）：103-106.

Enzymatic-ultrasonic extraction of total flavonoids from Scutellariaamoena and itsantioxidantactivities

LIU Haiou，HU Chunyan，ZHAO Shenglan，PU Chunxia，LIU Xiaoling，LIN Yuping*
（College of TraditionalChinese Medicine，Yunnan University ofTraditional Chinese Medicine，Kunm ing 650500，China）

The enzymatic-ultrasonic extraction condition of total flavonoids from Scutellaria am oena and its antioxidant activities were studied.The results indicated that enzymatic-ultrasonic method had synergistic effect on total flavonoids extraction from S.am oena，and had higher extraction rate.The optimum condition ofenzymatic-ultrasonic extraction wasobtained through single factor testand orthogonal testat the ultrasound power of 100W.The optimal conditionswere determined as follows:extraction time 4 h，ethanol concentration 55%，enzyme addition 50 U/g（drymaterial），liquid to solid ratio 30∶1，extraction temperature50℃.Under thecondition，the total flavonoidswere24.03%.Theantioxidant testsresults indicated that scavenging capacity（IC50）of S.amoena total flavonoids towardssuperoxideanionand hydroxyl radicalswere0.14mg/m land 0.20mg/m l，respectively.

cellulase；ultrasonic；total flavonoidsof Scutellaria amoena；extraction yield；antioxidantactivity

R282．71

0254-5071（2016）01-0110-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．024

2015-10-23

云南省教育厅重点项目（2014z119），云南省教育厅项目（2013y239）

刘海鸥（1991-），男，硕士研究生，研究方向为天然产物活性成分。

林玉萍（1975-），女，副教授，硕士，研究方向为天然药物活性成分。