一种酵素的配方优化研究

杨婧娟，李　娜，赵声兰（云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500）

一种酵素的配方优化研究

杨婧娟，李娜，赵声兰*
（云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500）

以芦荟、山楂、山药、薏苡仁和枸杞为主要原料研制一种酵素食品。应用最优混料设计法研究各主要原料的不同组合对产品主要品质指标的影响，建立各原料配比与目标值的回归模型，最终获得酵素最优原料配方为：芦荟10.00%、枸杞45.29%、山楂24.71%、山药10.00%、薏苡仁10.00%。以该原料配方进行发酵，得到的产品蛋白酶活力293.04U/g，超氧物歧化酶（SOD）酶活力57.00U/g，多糖含量11.42mg/g，综合评分为0.905 9。每克酵素样对超氧阴离子的清除能力相当于1mg抗坏血酸；每克酵素样对Fe3+的还原能力相当于129.25mg抗坏血酸；对大肠杆菌和金黄色葡萄球抑菌圈直径分别为12mm、10mm，抑菌能力与阳性对照苯甲酸钠相当。说明酵素产品具有一定的抗氧化作用及抑菌活性。

酵素；混料设计；酶活；抗氧化作用；抑菌活性

酵素食品是含有丰富酶类、维生素、矿物质及多种生物活性成分的功能性发酵食品，不仅可以促进正常新陈代谢，增强机体免疫，还具有消炎、抗菌、抗衰老、解毒、抗癌等功效［1］。由于生活压力增大、环境污染等因素造成人体内源性酶减少，食品精加工又使外源性酶受到破坏，不合理的饮食结构引起营养素缺乏，机体易出现酶失衡或作用减弱，营养不均衡而呈现亚健康状态。酵素食品可以有效调整机体酶系和营养平衡，使人体保持健康状态，因此，酵素作为一种养生食品越来越受到认可和推崇。目前已在日本、美国、台湾等地盛行，而在中国大陆发展相对缓慢，绝大多数酵素食品都源自进口，市场价格昂贵，对其制备方法进行科学研究具有巨大的价值。

混料设计法是研究产品中各种成分比例与指标关系，进行配方优化的有效方法，已在生产实践中广泛用于食品、医药、化工等领域［2-4］，但对酵素配方的优化研究目前少见报道。本研究主要应用D-最优混料设计试验法研究配方中各原料不同组合对酵素酶活及活性成分含量等主要品质指标的影响，在酵素制备过程中加入明确发酵菌种，在发酵条件可控的条件下拟得到综合酵素的最优配方，为酵素食品的制备提供科学有效的参考方法。

1　材料与方法

1.1料与试剂

新鲜山药、新鲜山楂、新鲜芦荟：购自昆明菜市；枸杞、薏苡仁：购自昆明一心堂药房；葡萄酒酵母、啤酒酵母（按1∶1比例混合使用）：云南中医学院微生物实验室菌种；L-酪氨酸标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用其他试剂均为国产分析纯。

1.2器与设备

DK-98ⅡA型水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；SC-3614型离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；SWCJ-2D型超净工作台：苏州净化设备有限公司；LDZX-40BI型灭菌锅：上海申安医疗器械厂；UV-1800PC型紫外-可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；GPZ14型分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；LRH-250生化培养箱：上海医疗器械五厂。

1.3验方法

1.3.1素制备工艺流程［5-6］

芦荟、山楂、山药、枸杞、薏苡仁→无菌水清洗→沥干、切丁→按设计的比例混匀→调节糖度（10%）及料水比（5∶1）→按3%比例接种酵母菌种→搅拌均匀→30℃固态发酵7 d→发酵产物按一定比例稀释打浆→离心取上清为酵素液。

1.3.2素指标检测

蛋白酶活力测定：按国标GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中福林法。蛋白酶活力定义：1m L液体酶（或1 g固体酶粉），在40℃条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位（U）。以L-酪氨酸为标准品，在波长680nm处测定吸光度值，绘制L-酪氨酸标准曲线（y=0.009 3x+ 0.011 0，R2=0.999 0）。取稀释至一定倍数的供试样与酪蛋白反应，反应滤液按标准曲线测定方法操作。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力测定：采用邻苯三酚自氧化法［7-8］。超氧化物歧化酶活定义：在1m L反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位（U）。

多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法［9］。以葡萄糖为标准品，于波长490 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线（y= 20.214 0x-0.011 3，R2=0.998 0）。取一定量酵素液，加入无水乙醇使含醇量达80%，静置过夜，抽滤后弃上清液，残渣用体积分数为80%乙醇洗涤3次，低温烘干，残渣用蒸馏水溶解并定容至250m L，得样品供试液备用。按照标准物质测定方法操作并根据标准曲线回归方程计算酵素样中的多糖含量。

1.3.3验设计

采用试验设计软件DesignExpert中混料设计D-Optional方法对酵素制备的配方进行优化，确定出各原料的最佳比例。试验选用芦荟、枸杞、薏苡仁、山楂、山药为配方原料成分，并设定各成分在配方中所占百分比（10%～50%）进行试验。

1.3.4素产品的抗氧化及抑菌活性评价

超氧阴离子自由基清除能力的测定［9］：利用邻苯三酚自氧化法测定酵素对超氧阴离子自由基清除能力，以不同质量浓度的抗坏血酸（ascorbic acid）同法制作标准曲线，计算酵素样的抗坏血酸当量抗氧化能力（ascorbicacidequivalentantioxidantcapacity，AEAC）。

铁离子还原能力的测定［10］：酵素还原力的评价参照文献［10］中铁离子还原能力测定方法进行，以不同质量浓度的抗坏血酸（ascorbic acid）同法制作标准曲线，计算酵素样的还原能力。

抑菌活性测定［11］：以大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）为指示菌，采样打孔法测定酵素样的抑菌活性，同时设置试剂空白（无菌水）及阳性对照（苯甲酸钠），培养结束后测定培养基中抑菌圈直径。

2　结果与分析

2.1型建立与分析

酵素配方设计及试验结果见表1。

表1　酵素的配方设计及试验结果Table1 Design and results of ferment formulation

续表

利用Design Expert软件对表1中3个响应值的结果进行二次多项回归拟合，得到Y蛋白酶活性、YSOD酶活性、Y多糖含量的回归模型，各回归模型方程如下：

对模型方程进行方差分析，得到蛋白酶活力的二次模型极显著（P＜0.01），SOD酶活力和多糖含量二次模型显著（P＜0.05）。蛋白酶活性、SOD酶活力和多糖含量3项指标的判断系数（R2）分别为0.982 6、0.961 5、0.968 3，表明试验结果与模型拟合程度良好。

2.2方中各原料变化对酵素蛋白酶、SOD酶活力及多糖含量的影响

本研究的配方中共有5种成分，固定其中两种组分，可以比较其他3种成分交互作用对指标的影响，结果见图1～图3所示。

图1表示山楂和薏苡仁在固定水平时，芦荟、枸杞和山药的交互作用对蛋白酶活性的影响。结果显示，响应曲面随着枸杞添加量增加的方向显著往上倾斜，说明枸杞添加量对蛋白酶活性影响较强，在三者中占主导地位。枸杞中含糖量高，尤其可供酵母直接利用的小分子糖含量高，为酵母快速生长代谢产酶提供了丰富碳源［12］。另外，枸杞中含丰富的蛋白质和氨基酸，粗蛋白含量4.49 g/100 g，氨基酸种类达18种，游离氨基酸占氨基酸总量的一半以上，对诱导蛋白酶产生具有关键作用［13］。

图1　芦荟、枸杞、山药的交互作用对蛋白酶活力影响的响应面和等高线Fig．1 Response surface plots and counter line of effectof interaction between aloe，m ed lar and yam on protease ac tivity

图2　山楂、山药、薏苡仁的交互作用对SOD酶活力影响的响应面和等高线Fig．2 Response surface p lots and counter line of effect of interaction between hawthorn，yam and coix seed on activity of SOD enzyme

图2表示芦荟和枸杞在固定水平时，山楂、山药和薏苡仁交互作用对SOD酶活力的影响。随着C（山楂）在配方中含量增加，SOD酶活力不断增强，而D（山药）、E（薏苡仁）含量增加，SOD酶活力呈下降趋势。山楂本身含有丰富的SOD酶［14］，增加其在配方中的比例可能会使酵素液中酶活相应增高；另外，山楂中丰富的维生素及钙、铁、磷等矿物元素为菌体生长提供了良好营养，利于其代谢产酶［15］。山药和薏苡仁在配方中含量增加对酶活力出现负影响，可能是由于这两种物质淀粉含量高，其需进一步被分解为小分子糖才可被利用，降低了菌体生长代谢速率；此外，薏苡仁和山药添加量高（淀粉量高），易造成培养基质黏粘，在发酵温度影响下，被薏苡仁粉包裹住的基质表面不断干化结块，影响菌体生长代谢活动，导致酶活降低。因此，配方中应适当控制山药和薏苡仁的添加量。

图3　芦荟、山楂、山药的交互作用对多糖含量影响的响应面和等高线Fig．3 Response surface p lots and counter line of effect of interaction between aloe，haw thorn，yam on po lysaccharide content

图3表示枸杞和薏苡仁在固定水平时，芦荟、山楂、山药交互作用对多糖含量的影响。随着C（山楂）和D（山药）在配方中添加量的增加，多糖含量呈现先减少后增加的趋势。由于山楂、山药中含有菌体生长所需的碳、氮源及各种矿物元素等，在营养丰富的情况下，微生物生长加快，大量繁殖的菌体为满足自身营养需求会将多糖分解利用，造成基质中多糖含量降低。而当添加量继续增大，基质中营养成分的量足以供菌体利用，微生物代谢活动增强，在此过程中可能产生酵母多糖等代谢产物［16］，致使含量上升。但是，由于山药添加过多易造成基质黏粘影响发酵，因此应结合酶活指标适当控制山药用量。

2.3合酵素制备最优配方的确定

配方的确定应优先考虑酶活，使酶活达到最佳水平基础上，尽可能在发酵过程中保留或获得活性物质，故本研究对指标确定的权重系数分别为：蛋白酶活力、SOD酶活力权重系数均为0.4，多糖含量权重系数为0.2。运用隶属度综合评分法［17］和赋予的权重进行加权求和得到各指标的综合评分（满分为1.0分），结果见表2。

其中隶属度按下式计算：

式中：L为隶属度；Ci为指标值；Cmin为指标最小值；Cmax为指标最大值。

以综合评分作为目标参数，利用Design Expert软件对综合评分结果进行二次多项回归拟合，建立Y综合评分的回归模型，回归模型方程如下：

表2　各指标综合评分Table 2 Com prehensive score value of each index

通过对模型方程的方差分析，结果见表3。由表3可知，酵素的综合评分线性混合模型和二次模型都达到极显著水平（P＜0.01），得到酵素综合评分的判断系数R2=0.9214，说明Y综合评分的变异中有92.14%是由变量（A、B、C、D、E）引起的，只有7.86%不能用该模型解释，模型拟合程度较好，因此可以用此模型对酵素的最优配方进行分析和预测。

表3　综合评分的二次多项回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic polynom ialmodel for com prehensive score

应用软件的最优化功能得到酵素配方的最优组合为芦荟10.00%、枸杞45.29%、山楂24.71%，山药10.00%、薏苡仁10.00%，在此点预测所得酵素的综合评分为0.928 5，按照优化后的配方制备酵素，得到的酵素各项指标值为蛋白酶293.04U/g，SOD酶57.00U/g，多糖含量11.42mg/g，综合评分0.905 9，与预测值基本接近，说明混料设计法在酵素配方设计和优化中的应用有效。

2.4素产品的抗氧化及抑菌活性特性

1.3.4法中所得酵素样清除超氧阴离子的AEAC值为1mg/g，即该酵素清除超氧阴离子能力，每克酵素样相当于1mg抗坏血酸；对Fe3+还原能力的AEAC值为129.25mg/g，即每克酵素样相当于129.25mg抗坏血酸，说明酵素产品具有一定的抗氧化活性。抑菌活性测定结果显示，酵素对大肠杆菌和金黄色葡萄球抑菌圈直径分别为12.00mm、10.00mm，苯甲酸钠对两种指示菌的抑菌圈直径均为12.00mm，说明酵素产品具有一定的抑菌活性，能力与阳性对照苯甲酸钠相当。

3　结论

本试验应用混料设计法研究了酵素制备各成分比例与指标的关系并得到了最优配方组合：芦荟10.00%、枸杞45.29%、山楂24.71%，山药10.00%、薏苡仁10.00%，以此为基础得到酵素产品各项指标值为蛋白酶活力293.04U/g，SOD酶活力57.00 U/g，多糖含量11.42 mg/g，其综合评分0.905 9，与预测值基本接近。将混料设计法应用于酵素食品的配方设计及优化，不仅快速有效，缩短了产品的开发周期，而且可在最大程度满足目标的条件下得到产品的最优配方组合，提高产品品质，方法科学合理，具有重要的应用价值。活性试验结果表明，酵素具有一定的抗氧化及抑菌活性，同时还含有丰富的蛋白酶、SOD酶及多糖等活性物质，因此，酵素是一种具有开发潜力的健康食品。

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Research on the formulaoptimization ofa ferment

YANG Jingjuan，LINa，ZHAO Shenglan*
（College ofTraditional Chinese Medicine，Yunnan University of TraditionalChinese Medicine，Kunm ing 650500，China）

A kind of ferment food，wasdeveloped w ith aloe，haw thorn，yam，coix seed andmedlar as raw material.Theeffectof themainmaterialson themain quality indicatorsof productwas researched by the optimum m ixture designmethod.The regressionmodel of the raw materials ratio and targetvaluewasestablished.Finally，the optimum formula of fermentwasobtained as follows:aloe 10.00%，medlar45.29%，hawthorn 24.71%，yam 10.00%，and coix seed 10.00%.Under theoptimum formula，thequality parametersof productobtainedwereproteaseactivity 293.04 U/g，superoxide dismutase（SOD）activity 57.00U/g，polysaccharide content11.42mg/g，comprehensive score 0.905 9.The ultra oxygen anion scavenging capacity wasexpressed as1mg ascorbic acid equivalents per gram ferment.The Fe3+reducing antioxidant powerwas expressed as129.25mg ascorbic acid equivalents per gram ferment.The antibacterial circle diameter of ferment on Escherichia coli and Staphylococcusball was12mm and 10mm，respectively.The antim icrobialactivity of fermentwasequivalent to sodium benzoate（positive control）.Thestudy indicated that the fermenthad a certain antioxygenation and bacteriostatic activity.

ferment；m ixturedesign；enzymeactivity；antioxygenation；bacteriostatic activity

TS205．5

0254-5071（2016）01-0095-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．021

2015-10-10

杨婧娟（1986-），女，助教，硕士，研究方向为天然产物研究与开发。

赵声兰（1962-），女，教授，硕士，研究方向为功能食品，药食资源开发与利用。