ARTP诱变选育中温α-淀粉酶高产菌株及其发酵条件优化

王兴吉，刘文龙，钱娟娟（山东隆科特酶制剂有限公司，山东 临沂 276400）

ARTP诱变选育中温α-淀粉酶高产菌株及其发酵条件优化

王兴吉，刘文龙*，钱娟娟
（山东隆科特酶制剂有限公司，山东 临沂 276400）

利用常压室温等离子体（ARTP）技术，对产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株进行诱变处理，通过平板、深孔板初筛及摇瓶复筛共筛选出3株酶活明显提高的菌株，其中产酶活力最高的突变株BS-12，摇瓶酶活达到了801U/mL，较出发菌株提高了32.2%。通过单因素试验，得到的最佳发酵条件为接种量6%，温度36℃，发酵时间68 h。在此条件下，摇瓶酶活力达到1 395U/m L，经30 L发酵罐放大，酶活达到了1 553U/m L。

常压室温等离子体；中温α-淀粉酶；发酵条件；优化；枯草芽孢杆菌

中温α-淀粉酶是指一类最适反应温度在50～70℃的α-淀粉酶，已经广泛应用于淀粉糖［1］、焙烤工业［2-3］、啤酒酿造［4］、酒精工业等行业，也用于饲料、纺织［5-6］、造纸［7］、医药［8］等各个领域。目前，国内对中温α-淀粉酶的研究不多，大多数科研院所已转向耐高温α-淀粉酶、酸性α-淀粉酶、碱性α-淀粉酶等领域。

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变技术的射流温度为25～35℃，且分布均匀，对于环境和人均无危害，无真空装置，设备简单易于操作，与生物大分子和细胞作用明显，同时有独特的SOS修复机制，基于以上优势，已经成为诱变领域的研究热点。本研究以枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过ARTP诱变技术进行诱变处理［9-10］，并对高产突变菌株的发酵条件进行优化，提高了生产能力和发酵水平，对促进我国酶制剂工业的发展具有现实意义。

1　材料与方法

1.1料与试剂

1.1.1株与试剂

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：本公司省重点实验室保藏菌株。

葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、磷酸氢二钠、氯化钙、琼脂均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母浸出物、酵母粉、营养肉汤：美国BD公司；糊精、玉米浆：青援食品有限公司；豆饼粉、玉米粉：市售。

1.1.2养基

斜面培养基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化钠1%，琼脂2%，pH值自然。

种子培养基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化钠1%，pH值6.6。

平板筛选培养基：葡萄糖2%，氯化钠0.2%，酵母粉0.2%，营养肉汤0.3%，蛋白胨0.5%，玉米淀粉1%，琼脂1.3%，pH值7.0左右。

深孔板、摇瓶发酵培养基：糊精4.2%，硫酸铵0.4%，磷酸氢二钠1.5%，氯化钙0.27%，调pH值7.0，加入碳酸钙1%。

30 L发酵培养基：玉米淀粉5%，玉米粉6%，豆饼粉1%，玉米浆1.4%，磷酸氢二钠0.8%，消泡剂、液化酶适量，pH 6.5。

1.2器与设备

ARTP-IIS常压室温等离子体诱变系统：无锡思清源生物科技有限公司；ZWF-B3612摇瓶机、ZXSD-A 1270生化培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；Plus384酶标仪：美国MD公司；5810R离心机：德国Eppendorf公司；30 L发酵罐：上海国强生化有限公司。

1.3法

1.3.1活测定方法

酶活的测定按照国家标准GB 8275—2009《食品添加剂—α-淀粉酶制剂》执行。

酶活定义：1m L液体酶于60℃，pH 6.0条件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/m L表示。

1.3.2菌悬液的制备

离心收集培养至对数期的种子液，用生理盐水洗涤两次，然后用生理盐水稀释成浓度为106～108CFU/m L的菌悬液。

1.3.3ARTP诱变

吸取10μL菌悬液于载片中央并涂抹均匀，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，调整照射距离2mm，气流量10 L/min，功率100W，然后进行诱变处理。本实验将出发菌株分别处理0、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s，通过菌落数计算菌株的致死率，并绘出致死率曲线［9］。致死率计算公式如下：

式中：m为经ARTP处理后平板上平均菌落数，CFU；n为未经ARTP处理平板上菌落数，CFU。

1.3.4变菌株筛选

初筛：采用平板和深孔板相结合的方法。将诱变后的菌液涂布于平板筛选培养基上，34℃培养36 h，挑选淀粉水解圈直径与菌落直径比值超过6.5的菌株；将这些菌落转入深孔板，34℃培养36 h，培养结束后用酶标仪测定上清液酶活［11-12］。

复筛：将初筛筛选出的诱变菌株分别进行摇瓶发酵，34℃培养50h，每组设置3个平行试验，发酵结束测定酶活。

1.3.5酵条件优化单因素试验

在原有发酵工艺基础上，在装液量100m L/500m L，摇床转速200 r/m in的条件下进行摇瓶培养，分别对接种量、温度、发酵时间进行优化。

接种量的确定：采用2%、4%、6%、8%和10%的接种量，34℃发酵50 h后测定酶活，以确定最佳接种量。

温度的确定：采取恒温发酵的方式，以32℃、34℃、36℃、38℃、40℃作为培养温度、按6%的接种量接种，发酵50 h后测定酶活，以确定最佳培养温度。

发酵时间的确定：按6%的接种量接种，36℃培养，发酵24 h后，每隔4 h测定酶活，以确定最佳发酵时间。

1.3.6优条件下的摇瓶实验

根据1.3.5的试验结果，选取最优发酵条件，进行摇瓶培养，发酵结束测定酶活。

1.3.730 L发酵罐放大实验

为了验证优化后发酵条件效果，采用30 L发酵罐对发酵条件进行放大实验。固定装液量60%，接种量6%，温度36℃，罐压0.06MPa，通气量3m3/h，发酵时间68 h。发酵结束后，测定酶活力。

1.3.8变菌株的遗传稳定性实验

诱变株在平板上进行6次传代培养，对每1代菌株进行摇瓶发酵，测定酶活力，以检测诱变菌株的遗传稳定性［13-15］。

2　结果与分析

2.1变菌株的筛选结果

2.1.1ARTP诱变致死率曲线的测定

按方法1.3.3对出发菌株诱变致死率进行计算，并获得致死率曲线，结果如图1所示。

图1　枯草芽孢杆菌的ARTP致死率曲线Fig.1 Fatality ra te curve of Bacillus subtilis with the ARTP treatm ent

由图1可知，随着诱变时间的增加，致死率不断上升。当诱变时间为15 s时，致死率＞90%，而时间达到20 s时，致死率＞99%，本实验将致死率设定为90%以上即可，故诱变处理时间确定为15 s。

2.1.2变菌株初筛

共挑选出1 600个淀粉水解圈直径与菌落直径比值超过6.5的菌落。通过深孔板筛选出酶活提高15%以上的诱变菌株共36株。

2.1.3变菌株复筛

将初筛筛选出的诱变菌株分别进行摇瓶发酵，测定其酶活力，摇瓶发酵后酶活测定结果见表1。由表1可知，菌株BS-12的发酵水平最高，所以选用BS-12进行后续实验。

表1　菌株复筛结果Tab le 1 Secondary screening results of the m utan t strains

2.2酵条件优化结果

2.2.1种量对酶活力的影响

接种量对菌株发酵酶活力的影响见图2。由图2可知，接种量＜6%时，酶活力随接种量的增大而增高，接种量＞6%时，酶活力随接种量的增大反而降低，当接种量为6%时，酶活力最高。接种量的多少主要影响菌体的生长速度和代谢强度，接种量小，延迟期长，不利于菌体快速大量繁殖；接种量大，菌体过早衰老，产酶期短，最终活力不高。故选择接种量为6%。

图2　接种量对α-淀粉酶活力的影响Fig.2 Effectof inoculum onα-am ylase activity

2.2.2度对酶活力的影响

温度对菌株发酵酶活力的影响见图3。由图3可知，温度对发酵活力有较大影响，温度低于36℃，菌体生长缓慢，不易形成高密度发酵；温度高于36℃，菌体生长快，自溶也快，发酵活力反而降低。温度36℃时，酶活力最高，为1 050 U/m L，因此最佳培养温度为36℃。

图3　温度对α-淀粉酶活力的影响Fig.3 Effecto f tem perature onα-am ylase activity

2.2.3酵时间对酶活力的影响

发酵时间对酶活力的影响见图4。由图4可知，24 h以后发酵液酶活力逐渐升高，随着时间的延长在发酵68 h时酶活力达到最高，68 h以后酶活力随着发酵时间的延长逐渐降低，故选择发酵时间为68 h。

图4　发酵时间对α-淀粉酶活力的影响Fig.4 Effectof different fermentation time onα-am ylase activity

2.2.4优条件下的摇瓶实验结果

在最优的发酵条件下，3批摇瓶培养，酶活力分别为1 383 U/m L、1 416 U/m L、1 395 U/m L，平均酶活达到1 395U/m L，较优化前提高了74.2%。

2.330 L发酵罐放大实验结果

在最优条件下采用30 L发酵罐对发酵条件进行放大实验，3批放大实验的酶活力分别为1 523U/m L、1 561U/m L、1 576 U/m L，平均酶活达到1 553U/m L，因此优化的发酵条件是可行的。

2.4变菌株的遗传稳定性

诱变株BS-12在平板上进行6次传代培养，对每1代菌株进行摇瓶发酵，测定酶活力，结果见表2所示。

表2　BS-12遗传稳定性结果Table 2 Genetic stability experiments resultof strain BS-12

由表2可知，经ARTP诱变的BS-12菌株具有良好的遗传稳定性，经6次传代后，摇瓶发酵活力都维持在1300U/m L左右。

3　结论

对ARTP诱变处理的枯草芽孢杆菌进行筛选，获取高产中温α-淀粉酶的突变株BS-12，摇瓶酶活达到了801U/m L，较出发菌株提高了32.2%。该菌株具有良好的遗传稳定性，6次传代后摇瓶发酵活力维持在1 300U/m L左右。

对诱变菌株发酵条件进行优化，确定的最佳发酵条件为接种量6%，温度37℃，发酵时间68 h。在此条件下，摇瓶酶活力达到1 395U/m L，经30 L发酵罐放大，酶活达到了1 553 U/m L。

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Screening of medium-temperature α-amylase high-yield strains by ARTP and its fementation conditions optimization

WANG X ingji，LIUWenlong*，QIAN Juanjuan
（Shandong Long Kete Enzyme Co.，Ltd.，Linyi276400，China）

The Bacillus subtilis strainswhich producemedium-temperature α-amylase weremutated by atmospheric and room temperature plasma（ARTP）mutagenesis.Three strains which had higherα-am ylase activity were screened through plate and deep hole plate screening and flask secondary screening.Thestrain BS-12 had the highestenzyme-producing activity of 801 U/m l，which was32.2%higher than thatof the original strain. A ftersingle factorexperiment，theoptimal fermentation conditionswereas follows:inoculum 6%，fermentation temperature 37℃and time 68 h.Under the condition，the enzyme activitywas1 395 U/m l in flask.However，the experimentwas scaled-up by 30 L fermentation tank，and the enzyme activity reached 1 553 U/m l.

atmospheric and room temperatureplasma；medium-temperatureα-amylase；fermentation conditions；optim ization；Bacillus subtilis

TQ925

0254-5071（2016）01-0078-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．017

2015-10-27

王兴吉（1970-），男，工程师，硕士，研究方向为酶制剂生产与开发。

刘文龙（1982-），男，工程师，硕士，研究方向为酶制剂生产与开发。