多菌混合发酵产纤维素酶及生物法预处理秸秆的研究

白春艳，魏如腾，侯红萍（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

多菌混合发酵产纤维素酶及生物法预处理秸秆的研究

白春艳，魏如腾，侯红萍*
（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

对实验室分离筛选的3株绿色木霉和6株枯草芽孢杆菌的生长及产酶情况进行了研究，综合确定绿色木霉绿2与芽孢杆菌S3为混合菌中产纤维素酶酶活最高的组合。在此基础上，采用解脂假丝酵母处理高粱秸秆。先将解脂假丝酵母的种子培养液按照3%的接种量接种到发酵产酶培养基中，隔24 h将绿色木霉绿2的孢子悬浮液按照2.67%的接种量接种到发酵产酶培养基中，再隔12 h将芽孢杆菌S3的种子培养液按照5.33%的接种量接种到发酵产酶培养基中，测定出的滤纸酶活（FPA）最高，为389.89 U/m L，比优化前提高了14.30%。

绿色木霉；枯草芽孢杆菌；混合菌；纤维素酶

Ketwords: Trichodermaviride；Bacillussubtilis；m ixed strain culture；cellulase

秸秆作为农作物经加工提取出果实后的剩余物，是一类极重要的可再生物质资源。但是目前我国秸秆资源并没有得到充分有效的利用，大量秸秆被直接用于焚烧、填埋，这不仅是生物质资源的极大浪费，并且严重污染空气和水源，影响动植物和人类的健康。因此，认识并了解我国农作物秸秆资源的利用开发和存在的主要问题，对于秸秆资源的合理化利用具有重要的意义。常见的秸秆预处理方法为物理预处理、化学预处理、生物预处理和组合预处理（如超声波与碱法联合预处理）。相比较而言，生物预处理方法因具有低能耗和环境友好的特点，近年来成为国内外研究的热点［1-3］。

真菌通过分泌到胞外的游离纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维素，细菌纤维素酶则是以形成多酶复合体结构而起作用。纤维素酶是多组分酶系，需要各组分协同作用才能分解纤维素物质。但是，现有菌株生产的纤维素酶普遍酶解效率偏低、易失活，因此，利用复合菌株发酵可以克服酶活力低，酶系不完全的缺点。经研究表明，解脂假丝酵母可以将天然小麦秸秆表面的蜡质层分解掉，这样可以省去利用酸、碱蒸煮法处理秸秆的步骤，降低对设备的要求，减少成本［4-7］。

本试验以实验室的几株高产纤维素酶菌株为出发菌株，从混菌发酵的角度出发，进行细菌与霉菌之间的混合发酵试验，在此基础上，确定最佳复合菌组合。在上述试验基础上，添加了解脂假丝酵母，利用高粱秸秆作为主要碳源，研究了解脂假丝酵母、绿色木霉绿2和枯草芽孢杆菌S3这3株菌的混合生长及产酶情况。本试验的目的旨在利用解脂假丝酵母来分解高粱秸秆的蜡质层，然后绿色木霉绿2将秸秆的纤维束结构崩解掉，最后细菌S3来吞食残部。这样的菌种混合发酵对分解高粱秸秆有很大的帮助。

1　材料与方法

1.1料与试剂

1.1.1剂

羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethylcellolose，CMC-Na）（分析纯）：天津市科密欧试剂开发中心；微晶纤维素：国药控股集团；水杨苷：美国Sigma公司；高粱秸秆、玉米芯粉、谷子秸秆：市售产品或自制；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市科密欧试剂开发中心。

1.1.2种

3株绿色木霉（Trichodermaviride）（绿1～绿3）、6株枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）（S1～S6）、解脂假丝酵母（Candida lipolytica）均为山西农业大学微生物实验室保藏。

1.1.3养基

（1）马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯200 g切块，加水煮沸20min，用四层纱布过滤，然后再在滤液中加入20 g蔗糖和15～20 g琼脂，加热溶化后补水至1 000m L，pH自然，121℃灭菌30min。

（2）牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，氯化钠0.5 g，水100m L，琼脂2 g，pH 7.2，121℃灭菌20min。

（3）麦芽汁培养基：取一定量的大麦芽，研磨，加入麦芽量4倍水，在55～60℃保温糖化，并不断的搅拌3～4 h，用纱布过滤去渣，煮沸后再用滤纸或脱脂棉过滤一次，加水稀释成10～12°Bx麦芽汁，加入2%琼脂，pH自然，115℃灭菌20m in。

（4）混合发酵产酶培养基：麸皮5 g，蛋白胨0.3 g，（NH4）2SO40.3 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.5 g，水100m L，pH自然，121℃灭菌20m in。

1.2器与设备

722E型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；奥林巴斯CX23双目显微镜：奥林巴斯（上海）映像销售有限公司；DHP-500型电热恒温培养箱：北京光明医疗仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；YXQ-LS-50S11压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3法

1.3.1维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定采用DNS法［8-9］。

1.3.2切葡聚糖酶活力的测定

在25m L刻度试管中加入0.5m L适当稀释的澄清酶液和1.0m L用pH 4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的质量浓度1%的羧甲基纤维素悬浮液。盖上塑料布，用橡皮筋扎紧。50℃水浴，振幅80mm，保温30m in。取出迅速加入DNS溶液2m L，100℃煮沸5min，水浴冷却后定容至25m L，摇匀，波长550 nm处测定吸光度值。反应生成的葡萄糖的量根据酶解葡萄糖标准方程（定容至25m L，测定CMC酶活）求得。酶活定义：在50℃、pH值4.8条件下，1min从底物溶液中分解产生1μg还原糖（表示为还原糖当量）所需要的酶量即为一个酶活单位，U/m L［10-12］。

1.3.3切葡聚糖酶活力的测定

在25m L刻度试管中加入0.5m L适当稀释的澄清酶液和1.0m L用pH 4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的质量浓度1%的微晶纤维素悬浮液，测定外切葡聚糖酶活力，方法同上。

1.3.4-葡萄糖苷酶活力的测定

在25m L刻度试管中加入0.5m L适当稀释澄清酶液和1.0m L用pH 4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制成的质量浓度1%的水杨苷溶液，测定β-葡萄糖苷酶活力，方法同上。

1.3.5纸酶活力的测定

在25m L刻度试管中放入1 cm×6 cm的新华滤纸条，加入0.5m L适当稀释澄清酶液和1.0m L pH 4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，测定滤纸酶活（filter paperactivity，FPA），方法同上。

1.3.6萄糖标准曲线的制作

用无水葡萄糖（105℃烘干至质量恒定）配制成1 mg/m L的葡萄糖标准溶液，分别取此标准溶液0、0.2m L、0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0m L、1.2m L于比色管中，补水至2.0m L，加入2.0m LDNS试剂，具塞沸水浴5min，立即冷却，终止反应，定容至25m L，摇匀后，在波长550 nm处测定吸光度值，每管重复测3次，结果取平均值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制曲线并建立回归方程。

1.3.7菌组合的接种方式、比例和时间的确定

分别在绿色木霉和枯草芽孢杆菌中进行筛选，通过比较其产酶的影响，得出最佳菌株组合。并继续与解脂假丝酵母进行组合，以三种复合菌株降解秸秆，并得出最佳接种量、时间以及接种比例。

2　结果与分析

2.1萄糖标准曲线的绘制

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.560 7x-0.007 5，相关系数R2为0.999 1，表明标准曲线线性关系良好。

2.2 S系列枯草芽孢杆菌酶活力的测定

取250m L三角瓶，装入100m L发酵产酶培养基，取8%细菌种子培养液接种到发酵产酶培养基上，35℃、150 r/min摇床振荡培养。培养液4 000 r/m in、4℃离心20 m in，上清液为酶液。分别取发酵1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d的粗酶液0.5m L测定其内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活，所得结果见表1。

表1　六株枯草芽孢杆菌各酶活之间的比较Table 1 Com parison ofenzyme activity ofsix strains of Bacillus subtilis

由表1可知，以内切酶活和外切酶活为例，枯草芽孢杆菌S2、S3、S4、S5酶活峰值较高，但枯草芽孢杆菌S2、S3、S4的峰值出现较早，分别在第4、第3天达到酶活最高值；以β-葡萄糖苷酶活和滤纸酶活为例，枯草芽孢杆菌S3、S4、S5酶活峰值较高，但枯草芽孢杆菌S3、S4的峰值出现较早。综合考虑，枯草芽孢杆菌S3和S4的酶活较高，而且峰值出现较早，选择S3和S4进行菌株混合试验。

2.3色木霉酶活力的测定

酶液处理方法同2.2。分别取1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d的粗酶液0.5m L测定其内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活，所得结果见表2。

表2　三株绿色木霉各酶活之间的比较Table 2 Compa rison of enzym e ac tivity of three strains of Trichoderma viride

由表2可知，绿1、绿2酶活峰值较高，而且峰值出现较早，分别在第4、第3天达到酶活最高值，选择绿1和绿2进行菌株混合试验。

2.4佳混合菌组合确定

由于天然单菌的酶组分单一、配比不均衡，故将不同菌种进行混合培养，优势互补，有利于完善纤维素酶组分、提高酶活、缩短产酶周期、提高纤维素降解效率，因此本试验选用酶活峰值较高，并且峰值出现较早的枯草芽孢杆菌S3、S4和绿色木霉绿1、绿2作为混合菌研究对象，以比例1∶1进行组合，以筛选出最佳菌种组合，实验结果见表3。

表3　四种混合菌各酶活之间的比较Table 3 Com parison of enzyme activity of four kinds of m ixed strain cu lture

由表3可知，四个组合所达到的最大酶活与四株单菌相比有不同程度的增加。说明组合后形成较好的生物降解体系。另外，据测得的酶活大小得出，组合2的内切葡聚糖酶活分别是出发菌枯草芽孢杆菌S3的2.24倍和绿色木霉绿2的2.15倍；外切葡聚糖酶活分别是出发菌枯草芽孢杆菌S3的2.81倍和绿色木霉绿2的2.55倍；β-葡萄糖苷酶活分别是出发菌枯草芽孢杆菌S3的3.00倍和绿色木霉绿2的3.34倍；滤纸酶活分别是出发菌枯草芽孢杆菌S3的2.03倍和绿色木霉绿2的2.06倍；综合考虑，组合2的4种酶活都比较高而且出现的峰值也较早。因此，选择枯草芽孢杆菌S3与绿色木霉绿2（1∶1）为最佳组合。

2.5合菌对不同秸秆的降解效果

为了研究绿色木霉与枯草芽孢杆菌酶系之间的互补作用，以内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶酶活和滤纸酶活为考察指标，确定最佳混合菌组合。根据参考文献［13-15］以水解滤纸的酶活力代表纤维素酶的总活力（FPA酶活）为考察指标。并采用折中的方法，取混合菌的培养温度为33℃。

取250m L三角瓶，装入100m L混合发酵产酶培养基，取组合2混合菌（绿色木霉绿2∶枯草芽孢杆菌S3=1∶1）培养液，以接种量8%接种到发酵产酶培养基上、33℃、150 r/m in摇床振荡培养。培养液4 000 r/m in、4℃离心20min，上清液为酶液。发酵原料是选自同一产地的高粱秸秆、谷子秸秆和玉米芯，粉碎过40目筛网，接种混合菌组合2培养液，适宜条件下培养6 d，测定FPA酶活。将玉米芯为唯一碳源时测得的FPA酶活定义为100%，比较相对FPA酶活的大小，结果见图2。

图2　不同秸秆对产酶的影响Fig.2 Effects of different straw on enzyme production

由图2可知，混合菌组合2对高粱秸秆的降解效果优于谷子秸秆和玉米芯，故后续试验采用高粱秸秆为发酵原料，即高粱秸秆作为主要碳源。

2.6色木霉与枯草芽孢杆菌接种方式、接种比例以及时间的确定

取250m L三角瓶，装入100m L发酵产酶培养基，高粱秸秆作为主要碳源，33℃、150 r/min摇床振荡培养。培养液4 000 r/min、4℃离心20min，上清液为酶液，取培养液进行试验。

2.6.1合菌接种方式对秸秆降解效果的影响

取组合2混合菌培养液8%接种到发酵产酶培养基上，在接种总量一定的条件下，将绿色木霉绿2和枯草芽孢杆菌S3按1∶1的比例采用同时接种、先接绿色木霉绿2，隔12 h接枯草芽孢杆菌S3和先接枯草芽孢杆菌S3，隔12 h接绿色木霉绿2三种接种方式，分别测定FPA酶活，结果见表4。

表4　不同接种方式对FPA酶活的影响Table 4 Effects of diffe rent inoculation m ethods on FPA activity

由表4可知，不同的接种方式酶活存在着差异。先接绿色木霉绿2，隔12 h接种枯草芽孢杆菌S3，这种接种方式其FPA酶活最高，为332.17U/m L。

2.6.2合2混合菌的接种比例对秸秆降解效果的影响

取组合2混合菌培养液在接种总量一定（8%）的条件下，先后接种到发酵产酶培养基上，按照先接绿色木霉绿2，隔12h接枯草芽孢杆菌S3的接种方式，采用绿色木霉绿2∶枯草芽孢杆菌S3=1∶1、绿色木霉绿2∶枯草芽孢杆菌S3=1∶2、绿色木霉绿2∶枯草芽孢杆菌S3=2∶1三种接种比例，分别测定FPA酶活，结果见表5。

表5　不同接种比例对FPA酶活的影响Table 5 Effects of different inoculation ratio on FPA activity

由表5可以看出，当绿色木霉绿2∶枯草芽孢杆菌S3接种量为1∶2（即绿色木霉绿2接种量2.67%，芽孢异菌S3接种量5.33%）时，其FPA酶活最高，为341.11U/m L。

2.6.3合菌的接种时间对秸秆降解效果的影响

取组合2混合菌培养液接种到发酵产酶培养基上，在接种总量为8%的条件下，按照先接绿色木霉绿2，再接枯草芽孢杆菌S3的接种方式，绿色木霉绿2∶枯草芽孢杆菌S3=1∶2的接种比例，采用不同的接种时间∶先接绿色木霉，隔12 h、24 h、36 h、48 h、60 h接枯草芽孢杆菌S3的种子液接入发酵培养基中发酵6 d，测定FPA酶活，结果见表6。

表6　枯草芽孢杆菌接种时间对FPA酶活的影响Table 6 Effects of Bacillus subtilis inocu lation time on FPA activity

由表6可以看出，菌龄对纤维素酶的生产有较大影响。当时间过短时，由于菌体数量不足，酶活较低；当时间过长时，酶活反而降低。所以，最适宜的接种时间为12 h，此时FPA酶活最高，为341.11U/m L。

综上可知，混合菌的接种方式为先接绿色木霉绿2，隔12 h接枯草芽孢杆菌S3、接种比例为绿色木霉绿2∶接枯草芽孢杆菌S3=1∶2。

2.7脂假丝酵母与混合菌对高粱秸秆降解的最佳接种量，接种时间的确定

取250m L三角瓶，装入100m L发酵产酶培养基，高粱秸秆作为主要碳源，33℃、145 r/m in摇床振荡培养。培养液4 000 r/min、4℃离心20min，上清液为酶液。在得出绿色木霉与枯草芽孢杆菌的接种条件后，再与解脂假丝酵母进行复配，得出三种混合菌的接种条件。

2.7.1脂假丝酵母与混合菌对秸秆降解的最佳接种量的确定

先将解脂假丝酵母的种子培养液按照不同的接种量1%、2%、3%、4%、5%、6%接种到发酵产酶培养基上，隔12 h再取8%组合2混合菌培养液按照优化的条件接种到发酵产酶培养基上，测定其FPA酶活，结果见表7。

表7　解脂假丝酵母接种量对FPA酶活的影响Table 7 Effects of C andida lipo lytica inoculum on FPA activity

由表7可知，解脂假丝酵母是可以将高粱秸秆表面的蜡质层分解掉，当解脂假丝酵母的接种量过高或过低时，其FPA酶活都很低，而当接种量为3%时，FPA酶活最高，为369.82U/m L。

2.7.2脂假丝酵母与混合菌对秸秆降解的最佳接种时间的确定

先将解脂假丝酵母的种子培养液按照3%的接种量接种到发酵产酶培养基上，分别隔0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h后，隔24 h将绿色木霉绿2的孢子悬浮液按照2.67%的接种量接种到发酵产酶培养基中，再隔12 h将枯草芽孢杆菌S3的种子培养液按照5.33%的接种量接种到发酵产酶培养基中，测定其FPA酶活，结果见表8。

表8　绿色木霉接种时间对FPA酶活的影响Table 8 Effects of Trichoderma viride inoculation time on FPA activity

由表8可以看出，先将解脂假丝酵母的种子培养液按照3%的接种量接种到发酵产酶培养基中，隔24 h将绿色木霉绿2的孢子悬浮液按照2.67%的接种量接种到发酵产酶培养基中，再隔12h将枯草芽孢杆菌S3的种子培养液按照5.33%的接种量接种到发酵产酶培养基中，其测定的FPA酶活最高，为389.89U/m L，FPA酶活比未优化前提高了14.30%。

3　结论

研究了绿色木霉与枯草芽孢杆菌共9株菌的生长及产酶情况，通过比较4组混合菌的酶活大小，综合确定组合绿色木霉绿2与枯草芽孢杆菌S3是产酶酶活最高的混合菌，在此基础上，采用解脂假丝酵母处理高粱秸秆。先将解脂假丝酵母的种子培养液按照3%的接种量接种到发酵产酶培养基中，隔24 h将绿色木霉绿2的孢子悬浮液按照2.67%的接种量接种到发酵产酶培养基中，再隔12 h将枯草芽孢杆菌S3的种子培养液按照5.33%的接种量接种到发酵产酶培养基中，其测定的FPA酶活最高，即389.89U/m L，其FPA酶活比未优化前提高了14.30%。

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Multi-strains fermentation for cellulose production and straw pretreatment with biological method

BA IChunyan，WEIRuteng，HOU Hongping*
（College ofFood Science and Engineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China）

The grow th and enzyme production conditions of three strains of Trichoderma viride and six strainsof Bacillus subtilis screened were studied.The results showed that the combination of T.viride 2 and B.subtilis S3 had the highest cellulose-producing activities.On this basis，sorghum straw was preprocessed by Candida lipolytica.Firstly，the seed cultureof C.albicans was inoculated into the fermentationmedium w ith inoculum 3%. Then after 24 h，spore suspension of T.viride 2 was inoculated into the fermentationmedium w ith inoculum 2.67%.Lastly，after 12 h，the seed culture of B.subtilis S3 was inoculated into the fermentationmedium w ith inoculum 5.33%.Under this condition，the FPA activity was highest of 389.89 U/m l，which increased by 14.30%than beforeoptim ization.

TS262．2

0254-5071（2016）01-0057-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．013

2015-09-29

山西省科技攻关项目（No.201403110192）

白春艳（1988-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物与发酵技术。

侯红萍（1965-），女，教授，硕士，研究方向为食品与发酵工程。