新疆乳品中乳酸菌的多样性及耐药性分析

聂　睿，于　洋，倪永清（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003）

新疆乳品中乳酸菌的多样性及耐药性分析

聂睿，于洋，倪永清*
（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003）

从新疆北部地区采集的样品中分离出103株乳酸菌并进行生理生化表型鉴定，对这些乳酸菌进行16S rRNA基因序列测序，构建系统发育树发现分离的乳酸菌主要为5个属分别为乳杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、魏斯式菌属、明串珠菌属。采用纸片扩散法（K-B）研究不同属中不同乳酸菌对8种常见抗生素的耐药性分析。耐药性研究表明，分别有6株对链霉素、新霉素有耐药性，5株对红霉素有耐药性，7株对卡那霉素有耐药性，8株全部对萘啶酸具有耐药性，4株对万古霉素、四环素具有耐药性，2株对头孢唑肟存在耐药性。

新疆；乳酸菌；多样性；耐药性

乳酸菌是一类发酵产物为乳酸的革兰氏阳性细菌的总称［1］，在20世纪初，术语“乳酸细菌”是用来指“乳中发酵产酸的生物”［2］。到目前乳酸菌主要分为乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、肉杆菌属、明串珠菌属等，约为36个属［3］，被广泛应用在乳品、果蔬、发酵肉品加工过程中。乳酸菌除了对这些产品的香气成分有所作用，其代谢产物（如有机酸、过氧化物、双乙酰、细菌素等）还能够抑制食源性的微生物对食品的污染［4］。特别是在发酵乳品中，乳酸菌作为起始发酵剂可以起到增香的作用。

随着工业发展，乳酸菌在能够促进食品的生物转化，改善产品感官特性以及提高发酵食品的质量和安全性能的同时还能够促进食品中营养物质的产生［5］。近20年由于人类在医药动物养殖业中滥用抗生素的现象较为严重，如果将携带可转移耐药因子的乳酸菌菌株应用在生产中，将会严重威胁到食品的安全性，因此乳酸菌的耐药性是目前国际上对其安全性评价的一个重要组成部分得到了国际普遍的关注，特别是由多重耐药性发展至对临床常用抗生素的普遍耐药性［6-8］。在2013年欧洲食品安全署（局）（european food safety authority，EFSA）颁布的安全资格认证（qualified presumption of safety，QPS）方案就明确要求获得安全认证的乳酸菌菌株应不存在获得性毒力基因［9］，2014年，世界卫生组织就人类及其食品消费链中抗生素抗性监管的缺失及一体化监管也做了重点关注［10］。

新疆地域广阔、草场肥沃、牛羊成群，是一个多民族聚集的地方，奶疙瘩、酸奶子、奶豆腐、奶皮子、酥油等乳品成为当地饮食中必不可少的组成部分。丰富的发酵乳品中孕育着天然乳酸菌的宝库，为研究新疆乳酸菌多样性提供了丰富的条件，也为发酵工业提供许多可开发和利用的资源。本研究对新疆不同地域来源的乳制品进行乳酸菌的筛选和鉴定，对所分离的菌株进行药敏性试验，为抗生素的合理使用和乳酸菌安全性评价提供参考。

1　材料和方法

1.1料

1.1.1品

固体奶疙瘩样品主要来源于自新疆北部地区的伊犁（YL）、塔城（TC）；液体酸马奶、酸牛奶样品来自博乐（BL）、阿勒泰（AT）地区。样品均为随机采取牧民自制乳制品。

1.1.2剂

30%H2O2溶液：天津市巴斯夫化学试剂厂；Tris-饱和酚：北生物商贸有限公司；乙醇：天津市致远化学试剂厂；琼脂糖：美国BBI公司；药敏纸片用滤纸片制成直径为7mm的圆形纸片，放入小西林瓶中121℃灭菌2 h。然后在无菌的条件下将抗菌原液加入装有纸片的小西林瓶，37℃、24 h烘干，剂量参照参考文献［11］。

1.1.3养基

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20g，吐温-80 1m L，MgSO4·7H2O 0.588 g，MnSO4·H2O 0.25 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000m L，pH 6.2～6.4。

MH肉汤培养基：牛肉粉2.0 g/L，可溶性淀粉1.5 g/L，酸水解酪蛋白17.5 g/L，pH值7.4±0.2。

Elliker琼脂培养基、M 17培养基、胆汁七叶灵苷叠氮钠培养基和乳酸杆菌选择性培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.2器与设备

ZWY-2102双层恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；141-122闭式0～150mm不锈钢游标卡尺：桂林广陆量具厂；0.22μm微孔滤膜：上海兴亚净化材料厂；5810R高速冷冻离心机：德国Eppendorf仪器公司；SPX智能生化培养箱：宁波市江南仪器厂；UVmini-1240紫外分光光度计：日本岛津公司；LAC-5040S全自动高压灭菌锅：韩国LabTech公司；BCD-265F冷藏冷冻箱：荣事达集团；WhitelyDG250厌氧箱：英国DonWhitely科学有限公司。

1.3法

1.3.1株的分离和纯化

固体样品：分别取所有奶疙瘩样品10g，捣碎，用90m L无菌水稀释于锥形瓶中充分搅拌均匀，充分溶解后于振荡器上振摇20min，使样品与水充分混合。

液体样品：1m L样品放入装有100m L无菌水三角瓶中，37℃摇床振荡40min得菌悬液。

吸取菌悬液，采用梯度稀释法分别涂布于5种不同的培养基上，每个梯度做3次平行。后将平板放置在37℃厌氧培养36 h，然后挑取单菌落纯化2次。

1.3.2株初筛

观察菌落形态颜色大小并对纯化后的单菌落进行革兰氏染色，过氧化氢试验，初步确定为疑似乳酸菌，将纯化好的菌株保存于20%甘油中，-80℃冷冻保存备用。根据参考文献［12］的方法进行生理生化试验部分。

1.3.3株鉴定

利用CTAB法提取乳酸菌DNA，采用通用引物27f/1492r进行16S rRNA扩增。将测定的16S rRNA序列与GENBANK数据库中的标准菌株进行BLAST同源性比对分析，运用MEGA4.0软件构建系统发育进化树。

1.3.4敏实验

效价的测定：采用肉汤稀释法，使用无菌试管用MH培养液对待测抗菌进行连续倍比稀释。再加入等量的待测菌液37℃恒温培养24 h，观察哪一个稀释度能一直细菌生长，即为测定终点，再与同样处理的标准抗生素的终点比较，得出所用抗生素的效价。效价（U/mg）是指抗生素的效价单位与质量（一般是mg）的折算比例。U指具有一定生物效能的最小效价单位。

纸片扩散法（K-B）测药敏性：用MRS液体培养基转接两次，得到活化菌株。将15m LMRS琼脂培养基倒入培养皿中。待凝固后，再倒入15m L含有10%新鲜菌液（菌液浓度为1×10-7CFU/m L）的软琼脂（0.8%的琼脂）。待上层培养基凝固冷却后，在无菌条件下将药片轻轻贴在培养基上，37℃培养24 h。为了提高实验准确性，每个实验重复3次。

2　结果与分析

2.1离的乳酸菌表型鉴定结果

分离的乳酸菌经过革兰氏染色镜检。从样品中共分离103株疑似乳酸菌。其中杆菌约占70%，球菌约占30%。菌株均为G+，无鞭毛、无芽孢、无荚膜。大部分菌落直径约1mm、乳白色、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑。根据《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化试验，结果如表1所示。

表1　乳品中乳酸菌菌株的鉴定结果Table 1 Identification results of lactic acid bacteria from dairy products

续表

在果糖实验中，只有BL4-2、BL5-4、TC2-5、TC1-2、AT1-6、TC2-4、YL5-2这7株菌为阴性，其他均为阳性。而TC2-4、TC1-2在葡萄糖与葡萄糖酸盐实验中的结果均为阴性，有一半株菌在半乳糖实验中显阳性，菌株YL5-2只在半乳糖实验中显阳性，其他各项实验均为阴性。大部分的菌株不能分解精氨酸，只有8株菌能够分解精氨酸产生NH3。在棉籽糖实验中，有6株菌实验结果为阳性，其他均菌株为阴性。

2.2于部分16S rRNA基因序列乳酸菌菌株系统发育树

将从乳品中分离筛选出的乳酸菌菌株的部分16S rRNA基因序列提交NCBI，通过BLAST工具在GenBank数据库中与已发表的16S rRNA基因序列进行同源性比对，并选取同源性最高的序列构建系统发育树（图1）。由系统发育树可知24株从乳中分离隶属于Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Weissella这五个属。雷霞［13］从内蒙古伊敏河牧区和海拉尔牧区地区主要为Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc，与本实验结果相似。孙天松等［14］对采集自新疆和蒙古国的4份传统发酵乳中分离鉴定，得到了10株乳杆菌和3株乳球菌有所不同。根据发育树菌株YL5-1、TC4-5、YL1-1、YL3-1与Enterococcus faecalis、Enterococcus durans和Enterococcus faeclum构成一个分支，且16S rRNA基因序列相度非常高，均为100%，可确定隶属于该属。Lactobacillus属包括的五株菌TC3-1、YL2-1、BL4-4、TC3-5和AT1-4分别与已知Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei构成一个分支且同源性序列相似度高，AT1-4与Lactobacillus casei构成另一个分支。菌株BL3-6、AT3-4分别与Lactococcus raffinolactis、Lactococcus piscium构成一个分支，菌株BL1-2、TC3-5与Lactococcusgarvieae构成一个分支。而菌株YL2-2、YL3-4与Lactococcus lactis，Lactococcus lactis subsp.lactis两个不同的种形成一个分支，这样只能确定隶属于Lactococcus属。Leuconostoc属包括TC1-2、TC2-4、BL3-2、AT1-6四株，且比对同源性在98%以上。Weissella属中的两株菌AT2-6、YL-5-2也与Weissella koreeniss、Weissella cibaria构成了两个分支，同源性＞99%。但是以上利用16S rRNA基因序列比对构建的发育树只能是对乳酸菌的初步属水平的鉴定，鉴定的结果还需要利用种间特异性PCR才能将乳酸菌鉴定到种。

图1　基于部分16SrRNA基因序列的乳酸菌系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on partial 16S rRNA sequences

2.3乳酸菌的耐药结果与分析

按照世界卫生组织规定的标准化纸片药敏测定法，常分为以下3个等级：耐药（Resistant，R）、敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）。

表2　乳酸菌的药敏实验结果Table 2 Antimicrobialsusceptibility results of lactic acid bacteria

本实验选用常见的8种抗生素对新疆乳品8种代表菌株进行耐药实验。实验结果显示菌株都存在耐药性，菌株不只对一种抗生素具有耐性，而是具有多重耐药性。6株对链霉素、新霉素耐药；5株对红霉素耐药；7株对卡那霉素耐药；8种菌株全部对萘啶酸耐药；4株对万古霉素、四环素耐药；2株对头孢唑肟耐药。宋晓敏等［15］在对发酵食品中乳酸菌耐药性现状分析中肠球菌属对万古霉素、红霉素具有耐药性。PAN L等［16］对11种中国发酵食品中分离的17株乳酸菌进行对氯霉素、卡那霉素、四环素、环丙沙星、氨苄青霉素、克林霉素和红霉素的抗性测定，发现耐药乳酸菌普遍存在于中国传统发酵食品中，其抗性发生率与原材料和生产区域有关。

3　结论

本实验从新疆部分地区分离出103株乳酸菌，通过形态学观察、生理生化实验及16S rRNA基因序列选取同源性最高的序列构建系统发育树，获得24株乳酸菌分别隶属于6个属。随后利用8种不同的抗生素对8种代表菌株进行耐药实验，实验结果显示，分别有6株对链霉素和新霉素有耐药性，4株菌对四环素和万古霉素有耐药性，7株对卡那霉素有耐药性，5株对红霉素具有耐性，所有用于药敏实验的菌株对萘啶酸都有耐药性，2株对头孢唑肟具有耐药性。不同来源的乳制品中分离到的优势菌群和菌种的多样性是不相同，主要有可能是地理，气候等自然环境的影响，以及少数民族牧民在制作乳品时采用的发酵温度、时间及方法，牧民的生活习惯以及挤奶使用的用具容器也存在差异，这就造成各个地区不同自然发酵乳制品中分离的乳酸菌种类存在着一定差异。通过药敏实验发现分离的菌株是存在不同水品的耐药性，可能会通过食物链传递到人的肠道致病菌埋下了巨大隐患，所以在今后对于乳酸菌的耐药性问题特别的关注。

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Diversity of lactic acid bacteria and analysis of their antibiotic resistance from the dairy products in Xinjiang

NIERui，YU Yang，NIYongqing*
（College ofFood Science，ShiheziUniversity，Shihezi832003，China）

103 strainsof lactic acidbacteriawere isolatedand identifiedby physiologicaland biochem icaltest from samplein thenorthern area Xinjiang，and then the strainswere identified by 16S rRNA sequencing and phylogenetic treewas constructed.Results showed that the isolated lactic acid bacteriamainly comprised fivegenera:Lactobacillus，Enterococcus，Lactococcus，Weissella，and Leuconostoc.Thedrug resistance testof lactic acid bacteria to eightkindsof common drugswere conducted by K-Bmethod.The results showed thatsix strainswere resistant to streptomycin，and six strains were resistantto neomycin，only fivestrainswere resistant to erythrocin，sevenstrainswere resistantto kanamycin.A llof eight strainswere resistant to nalidixic acid，fourstrainswere resistant to vancomycin，four strainswere resistant to tetracycline，and only two strainswere resistant to epocelin.

Xinjiang；lactic acid bacteria；diversity；antibiotic resistance

TS201．3

0254-5071（2016）01-0047-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．011

2015-10-26

新疆生产建设兵团博士资金专项（2011BB009）；新疆生产建设兵团青年科技创新资金专项（2011CB001）；石河子大学自然科学科学重点项目（ZRKX20104001）

聂睿（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物技术。

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向为微生物和分子生物技术。