啤酒酵母乙醛代谢关键酶相关性研究

崔云前，王君伟，李　红，金玮鋆（.齐鲁工业大学 生物工程学院，中德啤酒技术中心，山东 济南 50353；.中国食品发酵工业研究院，北京 0005）

啤酒酵母乙醛代谢关键酶相关性研究

崔云前1，王君伟1，李红2*，金玮鋆2
（1.齐鲁工业大学 生物工程学院，中德啤酒技术中心，山东 济南 250353；2.中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

乙醛是啤酒中的主要风味物质，其代谢主要来自酵母细胞。酵母中乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶是乙醛代谢的关键酶，对乙醛变化起着重要作用。跟踪啤酒酵母发酵过程中相对酶活力及乙醛变化，发现两种乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的相对酶活力与发酵过程乙醛含量变化具有一定相关性。同时对低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4与出发菌株啤酒酵母kb进行发酵试验，跟踪检测相对酶活力及乙醛含量，其乙醇脱氢酶Ⅰ和乙醇脱氢酶Ⅱ及乙醛脱氢酶相对酶活力均高于出发菌株，平均增幅分别为15.5%，11.6%和5%。3种酶活性的变化协同作用可以使乙醛含量降幅最大为33.8%。

乙醛；酵母；乙醇脱氢酶；乙醛脱氢酶；相对酶活

乙醛是啤酒中的主要风味物质，其代谢主要来自酵母细胞。酵母中乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶是乙醛代谢相关的主要酶。其酶活性在整个发酵过程中的变化导致了乙醛含量的变化。酿酒酵母利用糖酵解产生乙醇的代谢过程中，主要是葡萄糖经糖酵解途径（embden-meyerhofparnas，EMP）转化为丙酮酸，由丙酮酸脱羧酶催化还原生成乙醛，再经乙醇脱氢酶还原生成乙醇，同时伴随着乙醇向乙醛的逆转化，另外，乙醛经乙醛脱氢酶转化为乙酸。在酵母内整个乙醛代谢过程主要有丙酮酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的共同参与。其中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶对乙醛的出路起着至关重要的作用。酿酒酵母中有5种基因编码与乙醇代谢相关联的乙醇脱氢酶，分别是adh1、adh2、adh3、adh4和adh5［1-3］，其中的4种乙醇脱氢酶作用是将乙醛还原成乙醇，其中乙醇脱氢酶Ⅰ起着主要作用，一种乙醇脱氢酶（乙醇脱氢酶Ⅱ）是将乙醇氧化成乙醛［4］。乙醛脱氢酶是丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）旁路作用的第二种酶，负责氧化乙醛生产乙酸［5］。国内外已有众多关于酵母内乙醛脱氢酶及乙醇脱氢酶的研究，但多局限于酶的机理性质方面的研究［6］。酶与乙醛等代谢产物的研究多集中在引入基因工程技术定向改变啤酒酵母遗传及生理性状［7-8］。而未对酵母内酶活性与代谢产物变化相关性进行深入探讨。

在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶作用下，乙醛向乙醇和乙酸以及乙醇向乙醛的转化过程中涉及辅酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和还原型辅酶Ⅰ（nicotinam ide adenine dinucleotide hydrogen，NADH）的相互转化。通过酶系反应中辅酶的变化可用来表示乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶的酶活性大小。本研究集中于乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活性与乙醛的相关性探究。并对经高浓度乙醛筛选的抗乙醛酿酒酵母菌株与原始菌株的酶活性及乙醛含量变化进行对比研究。发现啤酒发酵过程中，酵母内乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶与乙醛含量的变化规律，找出筛选酿酒酵母相比原始酵母主要酶活性的变化及对乙醛含量的影响。为后续从酵母细胞内部相关酶活性及代谢机理方面找到有效降低啤酒乙醛等风味物质的研究打下基础。

1　材料与方法

1.1料与试剂

啤酒酵母kb：中国食品发酵工业研究院提供；低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4：中国食品发酵工业研究院筛选。

40%乙醛（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；琼脂（生化试剂）：北京奥博拓达科技有限公司；磷酸氢二钾（分析纯）：磷酸二氢钾（分析纯）：北京红星化工厂；乙二胺四乙酸（ethylene diam ine tetraacetic acid，EDTA）、氢氧化钾（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：北京化工厂；辅酶Ⅰ（NAD+）（纯度98%）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）（纯度98%）：百灵威科技有限公司；甘氨酸（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司；氯化钾（分析纯）：西陇化工股份有限公司。

1.2器与设备

LRH-250生化培养箱：上海一恒科技有限公司；SY-1000E：多用途恒温超声提取机：北京弘祥隆生物技术公司；LR10-2.4A高速冷冻离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；UV-1780紫外分光光度计：日本Shimadzu公司；PerkinElmer Auto-System XL高效气相色谱仪：美国珀金埃尔默公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；100L啤酒酿造设备：中国食品发酵工业研究院。

1.3验方法

1.3.1酒酵母发酵实验

三角瓶发酵：用带发酵栓三角瓶模拟啤酒发酵，主发酵温度12℃。

选用12°P麦汁：斜面菌株一环→5mL麦汁（20mL试管）（28℃、24h）→45mL麦汁（100mL三角瓶）（28℃、24h）→500mL麦汁（1 000m L锥形瓶），摇匀后加上发酵栓，去离子水密封，12℃发酵。

100 L发酵罐发酵：三级扩培酵母菌种液10 L（接种量为5%），罐装13°P麦汁60 L，采用12℃进行发酵实验，封罐后降到2℃［9］。每天跟踪测定相关数据（每天取样时间点相同）。

1.3.2母细胞的获取［10-11］

取30m L发酵液于离心管中（离心管需事先称质量并编号），以5 000×g离心5 m in，弃去上清液收集酵母细胞。用5m L 2mmol/L EDTA和超纯水分别清洗两次，每次以5 000×g离心10min。称量含有底层酵母泥的离心管质量，以计算得到酵母泥质量，将收集得到的酵母泥悬浮于100mmol/L的磷酸钾缓冲溶液（pH 7.5），得酵母细胞菌悬液。

1.3.3酶液的制备［12-14］

采用冻融-超声结合法对酵母悬液进行破壁处理，将菌悬液冷冻于-18℃冰箱，按12 h-3 h-3 h的时间进行3次冷冻。每次将冷冻的菌悬液4℃冰箱解冻10m in。最后一次4℃冰箱解冻后，解冻液置于超声提取机，温度0℃、功率350W、工作时间2 s、间歇时间5 s条件下进行超声10min。将超声后的菌悬液在10℃条件下10 000×g离心10min，吸取上清液作为细胞抽提物即粗酶液。

1.3.4活测定方法［15-16］

（1）乙醛脱氢酶酶活测定

配制3m L酶活反应体系（0.15mol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.5），0.001mol/LNAD+，1×10-4mol/L乙醛），其中以乙醛为反应底物。

同等温度条件下加细胞浸出液0.1m L，对照样为0.1m L超纯水。采用单池时间扫描，连续5min内，读取波长340 nm处吸光度值。

（2）乙醇脱氢酶酶活测定

①乙醇脱氢酶Ⅰ

配制3m L酶活反应体系（0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钾缓冲溶液（pH 9.0），0.001mol/LNAD+，1×10-4mol/L乙醛）其中以乙醛为反应底物。

同等温度条件下加细胞浸出液0.5m L，对照样为0.1m L超纯水。采用单池时间扫描，连续5min内，读取波长340 nm处吸光度值。

②乙醇脱氢酶Ⅱ

配制3m L酶活反应体系（0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钾缓冲溶液（pH 9.0）缓冲液，0.001mol/L NADH，0.1mol/L乙醇）其中以乙醇为反应底物。

同等温度条件下加细胞浸出液0.5m L，对照样为0.1m L超纯水。采用单池时间扫描，连续5min内，读取波长340 nm处吸光度值。

酶活定义：常温条件下，3m L酶活性测定反应体系，5m in内NADH的增加或减少量表示酶的活性大小，即每分钟波长340 nm下吸光度值增加0.001为一个活力单位，U。本研究酶活性以测得酶活性值除以酶液对应酵母泥质量表示（U/mg）。

1.3.5醛含量测定［17］

乙醛含量采用顶空气相色谱仪进行测定。DB-WAX毛细管柱（0.25mm×0.25μm×30m），选取内标：3-庚酮。具体测定条件如下：

顶空进样器平衡温度70℃，平衡时间30m in，传输线温度130℃，进样时间0.04min，进样口温度200℃，检测器温度250℃，色谱柱初始温度40℃，经程序升温10℃/min升至180℃，柱流速1.2m L/min，载气（N2）流速30m L/min，燃气（H2）流速：47m L/m in，助燃气（空气）流速400m L/min。

2　结果与分析

2.1醛含量与三种酶酶活在三角瓶发酵过程中的变化规律

2.1.1角瓶发酵过程中乙醛含量及三种酶活性的变化

三角瓶发酵条件下，每隔1 d测定发酵液中乙醛含量、乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ酶活，结果见图1。

图1　三角瓶发酵3种酶相对酶活与乙醛含量实时跟踪图Fig．1 Real-time tracking graph of relative enzyme activity of three kinds of enzym es and acetaldehyde content in triangular flask fermentation

由图1可知，发酵1～3 d，乙醛含量快速增加，乙醛脱氢酶及乙醇脱氢酶Ⅱ的酶活有所增加，乙醇脱氢酶Ⅰ的酶活有所下降。第3天以后，乙醛含量开始下降，同时乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶Ⅱ酶活也随之下降，而乙醇脱氢酶Ⅰ酶活则呈相反趋势。

2.1.2角瓶发酵过程酶活与乙醛含量相关性分析

三角瓶发酵条件下，对3组平行试验酶活与乙醛含量数据经SPSS相关性分析，结果见表1。

表1　相对酶活力与乙醛含量相关性Table 1 Co rrelation between relative enzym e activity and acetaldehyde content

由表1可知，乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶Ⅱ酶活变化与乙醛含量在0.01水平上有正相关性，相关系数分别为0.845和0.690。而乙醇脱氢酶Ⅰ与乙醛含量在0.01水平上呈负相关性，相关系数为-0.630。这与图3乙醛含量与酶活变化趋势相吻合，而相关系数大小偏低，说明单独某种酶无法决定乙醛含量的变化而是3种酶共同作用的结果。

2.2醛含量与3种酶酶活在100 L发酵罐过程中的变化规律

2.2.1100 L发酵罐发酵过程中乙醛含量及三种酶活性的变化

100 L发酵罐条件下，筛选低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4与原始啤酒酵母kb，在相同条件啤酒发酵试验，跟踪测定酵母体内3种酶的活性，结果见图2。

图2　两种酵母100 L发酵乙醇脱氢酶Ⅰ（A）、Ⅱ（B）及乙醛脱氢酶（C）酶活实时跟踪图Fig．2 Real-tim e tracking graph of relative enzyme activity of a lcohol dehydrogenase I（A），alcoholdehydrogenase II（B）and aldehyde dehydrogenase（C）in 100 L fermentation for two yeast strains

由图2可知，经筛选的低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4在整个主发酵时期（第二天除外），其酶活性（乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ，乙醛脱氢酶）均高于原始菌株。

同时计算筛选低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4与原始啤酒酵母kb所测酶活的每天的增幅值，结果见表2。

由表2可知，筛选菌株的3种酶（乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ，乙醛脱氢酶）的酶活对原始菌株的最大增幅分别为30%、19.7%和14%，而平均增幅分别为15.5%、11.6%和5%。在发酵第2天两种酵母酶活性相同，可能是主发酵的第2天酵母增殖量较大，其酶活变化不明显。两种酵母的乙醛脱氢酶在整个发酵过程中变化不明显，且在第1天出现负的增幅，可能是筛选的酵母菌株相对原始菌株在乙醛脱氢酶的酶活性上没有发生较大改变，而主要是乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ的酶活性发生了变化。

表2　筛选菌株相比原始菌株相对酶活增幅Table 2 Increase am plitude of the relative enzyme activity of screened strains compa red with the original strain

2.2.2100 L发酵罐发酵中乙醛含量变化比较

100 L发酵罐条件下，筛选低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4与原始啤酒酵母kb，在相同条件下啤酒发酵试验，跟踪检测乙醛含量，结果见图3。

图3　两种酵母100 L发酵乙醛含量实时跟踪图Fig.3 Real-tim e tracking graph of acetaldehyde content in 100 L ferm entation of two yeast strains

由图3可知，整个发酵过程中筛选酵母菌株与原始酵母菌株乙醛含量变化趋势大致相同而筛选菌株每天的乙醛含量却更低。

计算筛选低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4相对原始啤酒酵母kb乙醛含量的降幅值，结果见表3。

表3　筛选菌株相比原始菌株乙醛含量降幅Table 3 Decrease am plitude o f acetaldehyde content of screened stra ins com pared w ith the o riginal strain

由表3可知，第10天其相对降幅最大为33.8%。第2天降幅最小为4.5%，主要因为在第2天3种酶的酶活变化率都接近为零，使得第2天的乙醛含量差值也较小。结果表明，3种酶活性的变化协同作用可以使乙醛含量降幅最大为33.8%。

经筛选低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4与原始啤酒酵母kb经100L啤酒发酵，两种乙醇脱氢酶的酶活性均高于原始菌株，而乙醛脱氢酶酶活性变化不明显且筛选低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4乙醇脱氢酶Ⅰ相对原始啤酒酵母kb的平均酶活增幅（10%）低于乙醇脱氢酶Ⅱ活性增幅量（16%）。而最后发酵液的乙醛含量低于原始菌株发酵液含量。可推测乙醇脱氢酶Ⅰ在乙醛的代谢中起着主导作用。

3　结论

啤酒发酵过程中乙醛含量主要受酵母细胞内乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶的变化作用。其相对酶活性的增加或降低其乙醛含量也随发生变化。

经高浓乙醛筛选的抗乙醛酿酒酵母经10发酵跟踪测定酶活性，其乙醇脱氢酶Ⅰ，乙醇脱氢酶Ⅱ和乙醛脱氢酶酶活相比原始菌株均有一定增幅，平均增幅分别为15.5%，11.6%和5%。乙醇脱氢酶Ⅱ酶活的增幅（即催化乙醇向乙醛方向增幅）小于乙醇脱氢酶Ⅰ和乙醛脱氢酶的增幅（即乙醛向乙醇和乙酸转化方向的增幅），且乙醇脱氢酶Ⅰ的增幅更大，而乙醛脱氢酶变化较小且有起伏。3种酶活性的变化协同作用可以使乙醛含量降低幅最大为33.8%，验证了乙醛含量变化是酵母细胞内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶共同作用的结果。且筛选低产乙醛啤酒酿酒酵母kb2-4相对原始原始啤酒酵母kb主要是与乙醛代谢相关的乙醇脱氢酶酶活性发生了较大改变。

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Correlation of key enzymes of acetaldehyde metabolism in beer yeast

CUIYunqian1，WANG Junwei1，LIHong2*，JINWeiyun2
（1.College ofBiological Engineering，Qilu University ofTechnology，China-Germany BeerBrew ing TechnicalCenter，Jinan 250353，China；2.China NationalResearch Institute ofFood and Fermentation Industry，Beijing 100015，China）

Acetaldehyde is themain flavorsubstance in beer，and itsmetabolism mainly occurs in yeast cells.A lcoholdehydrogenase（ADH）and aldehydedehydrogenase（ALDH）in yeastare the key enzymes in theacetaldehydemetabolism，which playsan important role in the changesofacetaldehyde.By tracking the relative enzyme activity and acetaldehyde changes during beer yeast fermentation process，the results showed the relative enzyme activity of two kindsof ADH and ALDH had certain relevancew ith the changesof acetaldehyde content during fermentation process.At the same time，in the fermentation testof low yield acetaldehydebeer brew ing yeastkb2-4 and original strain beer brewing yeastkb，the relative enzyme activity and the acetaldehyde contentweredeterm ined.The relative enzymeactivity of ADH I，ADH IIand ALDH werehigher than thatof the original strain，and theaverage grow th rateswere5%，11.6%and 15.5%，respectively.Thesynergistic effectof the threekindsof enzyme activity changes couldmake theacetaldehyde contentdecreasing amplitude to themaximum of 33.8%.

acetaldehyde；yeast；alcoholdehydrogenase；aldehydedehydrogenase；relative enzyme activity

TS261．4

0254-5071（2016）01-0029-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．007

2015-11-19

国家国际科技合作专项项目（2014DFG31770）

崔云前（1969-），男，副教授，博士，研究方向为现代啤酒酿造技术。

李红（1978-），男，高级工程师，博士后，研究方向为现代啤酒酿造技术。