酶解乳清蛋白制备降胆固醇活性肽的工艺研究

蒋　琛，李晓东*，马丽媛，杜玲玲，刘　璐

（1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北农业大学 食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061）

酶解乳清蛋白制备降胆固醇活性肽的工艺研究

蒋琛1，李晓东2*，马丽媛3，杜玲玲2，刘璐2

（1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北农业大学 食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061）

利用生物酶技术酶解乳清蛋白，制备具有降胆固醇活性的多肽，通过响应面试验、二次旋转回归设计建立回归模型，以胆固醇胶束溶解度抑制率为评价指标，对乳清蛋白的酶解条件进行了优化。结果表明，乳清蛋白的最佳酶解条件为：酶解时间8.5 h、酶解温度55℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%，在此条件下，酶解乳清蛋白得到的活性肽的胆固醇胶束溶解度抑制率为18.21%。

乳清蛋白；降胆固醇活性肽；酶解；抑制率

乳清是生产干酪及干酪素过程中得到的大量液态副产物［1］，含有丰富的营养成分，其主要成分乳清蛋白的营养价值极高［2-3］。近年来的研究表明，乳清蛋白酶解物中含有多种生物活性肽，已成为人们的研究热点［4-5］。目前，国内外有关降血压肽的研究较多，而对降胆固醇肽的研究多是以大豆蛋白为原料［6-7］，而更具有研究价值的乳清蛋白源降胆固醇肽研究较少［8］。NAGAOKA S等［9］通过小鼠生物试验研究表明，相比大豆蛋白或酪蛋白，牛乳清蛋白源生物活性肽具有更强地降低血液胆固醇的活性。

生物活性肽的制备方法有很多，酶解法是其中最常用的方法，它是通过适宜的生物酶制剂对蛋白质进行限制级水解，使其逐步释放出活性多肽［10］。此法具有条件温和、成本低、安全性高等特点，已经在生物活性肽的生产中得到广泛应用。在生物活性肽的产业化进程中，针对不同蛋白来源的工具酶选择、酶解蛋白肽类的专一性释放等将是今后研究的主攻方向［11］。乳源生物活性肽因其安全性以及生理功能的多样性，已成为医疗保健研究领域的热点［12-13］。随着人们健康意识的日益增强及对营养强化食品、保健功能食品和膳食补充剂需求的增长，生物活性肽的研究开发具有巨大的发展前景［14-15］。本研究采用响应面法对乳清蛋白酶解工艺条件进行了优化，并利用体外检测技术确定水解活性肽的降胆固醇活性。确定了乳清蛋白最佳酶解工艺条件，为酶解乳清蛋白制备降胆固醇活性肽提供了理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

乳清蛋白：新西兰恒天然集团；胰蛋白酶：美国Sigma公司；胆固醇标准品：上海惠世生化试剂有限公司；牛磺胆酸钠：天津市光复精细化工研究所；甲醇（色谱纯）：江苏汉邦科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

WIGGENS数字式搅拌器：澳大利亚新港科学仪器公司；DZW-4型恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；XP504电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；721型分光光度计：上海元析仪器有限公司；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；TDL-500B冷冻离心机：北京医用离心机厂；LGJ-1型冷冻干燥机：北京医用分析仪器厂；DHP-9162型电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；KQ-500B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1乳清蛋白活性肽的制备

取一定量的乳清蛋白配制成一定含量的水溶液，置于恒温水浴锅中90℃高温灭酶活10 min后，冷却至酶解温度，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节酶解液pH值至适宜条件，加入一定量的胰蛋白酶，用数字搅拌器进行搅拌，水解过程中不断加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液以维持pH在适宜范围内，水解结束时将水温再次调至90℃高温灭酶活10 min，4 000×g离心10 min，排除沉淀，上层清液即为乳清蛋白活性肽溶液。冷冻干燥，-20℃保存备用。

1.3.2胆固醇标准曲线的绘制

按照丁卓平等［16］的方法略作修改。0.1 mg/mL胆固醇标准使用液的配制：准确称量胆固醇标准品0.1 g溶于冰醋酸中，并定容至100 mL，吸取上述溶液10 mL用冰醋酸定容至100 mL，此溶液即为0.1 mg/mL胆固醇标准使用液。铁矾显色剂的配制：准确称取硫酸铁铵4.463 0 g，溶于100 mL 80%的磷酸中，吸取20 mL此溶液用硫酸定容至250 mL，贮存于硅胶干燥器中。胆固醇标准曲线的绘制：吸取胆固醇标准使用液0、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，分别置于25 mL具塞比色管中，在各管中分别加入冰醋酸8.0 mL、7.0 mL、6.0 mL、4.0 mL、2.0 mL、0，再分别加入4 mL铁矾显色剂，振荡摇匀，在30～40min内，于波长560 nm处测定吸光度值，并绘制标准曲线，同时建立回归方程。

1.3.3活性肽胆固醇胶束溶解度抑制率的测定

参照张晓梅等［17］的方法并略作修改。配制模拟胆汁胶束溶液包含：0.01 mol/L牛磺胆酸钠，0.002 mol/L胆固醇，0.005 mol/L油酸，0.135 mol/L-氯化钠，0.015 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.4），5 mg/mL乳清蛋白活性肽粉末，通过超声波乳化，然后37℃培养24 h，100 000×g离心60 min后取上清液测定胆固醇含量。上清液中的胆固醇含量即为胆固醇胶束溶解度（mol/L），以不加活性肽的胶束溶液为空白，活性肽对胆固醇在模拟胆汁胶束溶液中的溶解度的抑制率计算公式如下：

1.3.4响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，选择酶解温度（A）、酶解时间（B）、pH值（C）、加酶量（D）和乳清蛋白含量（E）5个因素为试验因子，以胆固醇胶束溶解度抑制率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件进行5因素二次旋转回归试验设计，运用响应面分析法对乳清蛋白降胆固醇肽的酶解工艺条件进行优化，响应面试验因素与水平编码见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2　结果与分析

2.1胆固醇标准曲线的绘制

采用紫外分光光度法测定不同质量浓度的胆固醇在波长560 nm处的吸光度值，以胆固醇含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制出胆固醇标准曲线，结果如图1所示。

图1　胆固醇标准曲线Fig.1 Standard curve of cholesterol

由图1可知，胆固醇标准曲线线性回归方程为：y=0.012 1x-0.018 8，相关系数R2=0.998 1，表明二者线性关系良好，可用于计算样品溶液中的胆固醇含量。

2.2响应面法优化酶解工艺条件

采用响应面分析法对酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶解pH（C）、加酶量（D）、乳清蛋白含量（E）进行优化，以胆固醇胶束溶解度抑制率（Y）为响应值，响应面分析方案及试验结果见表2。

利用Design Expert 8.0.6软件对表2进行回归分析，经回归拟合后，建立多元二次回归方程如下：

表2　响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

对该模型进行方差分析和显著性检验，结果如表3所示。

表3　回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3分析可知，模型P＜0.0001，判定系数R2为0.987 5，说明该回归模型达到显著水平，预测值与实测值之间具有极高的相关性，校正决定系数R2adj为0.939 0，说明该模型能解释93.90%响应值的变化。模型失拟项P值为0.056 5＞0.05，此模型失拟不显著，说明模型选择合理。各因素对抑制率影响作用大小的顺序依次是：D＞E＞A＞C＞B，即加酶量＞乳清蛋白含量＞酶解时间＞pH值＞酶解温度。模型中D、E、DE、A2、E2、C2、D2、B2对响应变量的影响均极显著，而A、C、AE影响显著，其他不显著，这表明试验因素对响应值不是简单的线性关系。失拟项不显著，说明模型拟合度良好，此模型可用来对乳清蛋白酶解工艺条件进行分析和预测。

为进一步直观分析响应面优化效果，根据回归模型绘制相应的响应曲面图，结果见图2。

图2　酶解时间、加酶量和乳清蛋白含量交互作用对胆固醇胶束溶解度抑制率的响应曲面和等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between enzymolysis time，enzyme addition and whey protein content on cholesterol micelle solubility inhibition rate

由图2可知，加酶量和乳清蛋白含量交互的等高线最密，响应面最陡，同时二者交互作用的F值大于其他因素两两交互作用的F值，且P值最小，因此二者交互对抑制率的影响最大；随着乳清蛋白含量增大，加酶量增加，水解产物的抑制率先急速增加后缓慢降低；其次酶解时间和乳清蛋白含量的交互作用也较大，响应面较陡，并且二者交互作用的F值仅次于加酶量和乳清蛋白含量交互作用的F值，因此二者对抑制率的交互作用也比其他因素两两交互作用大；随着乳清蛋白含量增大，酶解时间延长水解产物的抑制快速增加后缓慢降低；除此之外，其他因素的两两交互作用均不显著，其中pH值和加酶量的交互作用最小，曲面较平缓，同时方差分析得到二者交互作用的F值最小，说明二者交互作用对抑制率的影响最小。

2.3验证试验

经Design Expert 8.0.6软件的优化预测并结合实际酶解情况，得到最佳酶解条件为酶解时间8.5 h、酶解温度55℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%，此时抑制率为18.24%。按照上述条件进行验证试验，得到抑制率的实际值为18.21%。模型预测值与实际值相差较小，证明该模型对实际工艺操作具有一定的指导意义。

3　结论

本试验采用响应面法研究了乳清蛋白的酶解工艺条件，确定了各工艺条件的最佳水平为酶解时间8.5 h、酶解温度55℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%，在此条件下水解乳清蛋白得到的活性肽的胆固醇胶束溶解度抑制率为18.21%。各因素对降胆固醇活性的影响作用大小的顺序依次是加酶量＞乳清蛋白含量＞酶解时间＞pH值＞酶解温度。以此确定的乳清蛋白最佳酶解工艺条件，为酶解乳清蛋白制备降胆固醇活性肽的深入研究提供了理论基础。

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Technology of hypocholesterolemic active peptides from enzymatic hydrolysis of whey protein

JIANG Chen1，LI Xiaodong2*，MA Liyuan3，DU Lingling2，LIU Lu2
（1.College of pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150030，China；2.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；3.College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua University，Suihua 152061，China）

The hypocholesterolemic active peptides were prepared from enzymatic hydrolysis of whey protein by biological enzyme technology.The regression model was established by response surface methodology and quadratic regression revolution design.Using inhibition rate of cholesterol micelle solubility as evaluation index，the enzymolysis condition of whey protein were optimized.The results showed that the optimum enzymolysis condition of whey protein were enzymolysis time 8.5 h，temperature 55℃，pH 8.0，enzyme 4.7%，whey protein content 5.8%.Under the conditions，the inhibition rate of cholesterol micelle solubility was 18.21%.

whey protein；hypocholesterolemic active peptides；enzymolysis；inhibition rate

R284.2

0254-5071（2016）03-0070-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.016

2015-09-23

黑龙江中医药大学科研基金（201418）

蒋琛（1980-），男，助理研究员，硕士，研究方向为乳品科学。

李晓东（1968-），男，教授，博士，研究方向为乳品加工。