海洋枝顶孢霉BH0531对黄瓜根结线虫防治的微生态效应

黄　敏，刘晓霞，申佩娟，蔡　爽，冯　欣，2，孟庆恒，2*，孙建华，2

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

海洋枝顶孢霉BH0531对黄瓜根结线虫防治的微生态效应

黄敏1，刘晓霞1，申佩娟1，蔡爽1，冯欣1，2，孟庆恒1，2*，孙建华1，2

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

测定了海洋枝顶孢霉BH0531发酵液在室内离体条件下对根结线虫的杀线效果，分析了盆栽试验条件下对黄瓜根结线虫指数、减退率及对土壤中微生物数量的影响。结果表明，发酵原液浓缩1倍时，其对根结线虫的校正死亡率高达96.2%；虫口减退率达到71.21%；发酵液对土壤中细菌和放线菌数量均有促进作用，细菌和放线菌数量分别最高达到1.24×108CFU/mL及1.56×106CFU/mL，而对真菌则表现出高浓度时的抑制作用，高浓度组真菌由原来的3.12×104CFU/mL减少至8.67×103CFU/mL；随着时间的延长，促进作用减弱，但对真菌的抑制作用未减弱。菌株BH0531发酵液可通过杀线作用、促进细菌和放线菌生长、以及降低土壤真菌化程度等微生态效应来实现对黄瓜根结线虫病的防治作用。

海洋枝顶孢霉；黄瓜根结线虫；线虫减退率；土壤微生物；微生态效应

植物寄生线虫是一类重要的植物病原物，其所造成的经济损失可高达1 570亿美元每年［1］。其中的根结线虫（Meloidogynespp.），因其分布广、寄主多，危害也最为严重，对植物根结线虫病害的防治也更受重视［2］。由于化学农药残留时间长、毒性大，且与环境友好的要求相悖，所以逐渐受到限制。生物防治也就成为关注的热点，并且已经取得一定的研究成果，如已经上市并得到应用的淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）生防制剂和阿维菌素等［3-4］。区别于上述菌种，海洋来源的枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531是一株具有杀线虫活性的丝状海洋真菌［5］，研究表明，其代谢物产物具有水溶性好、分子质量小、热稳定性好等特点［5-6］；该菌在实验室条件下对人工培养的松材线虫和根结线虫均显示出较好的杀线活性［7］。

土壤中的根结线虫指数和土壤微生物是植物根结线虫病害发生过程中两个重要的微生态生物要素。土壤微生物可以代表土壤中物质代谢的旺盛程度，是土壤肥力的一个重要指标，能反映植物和微生物对土壤物质积累的贡献，但又土壤各方面因素的影响［8］。在有机质的矿化、腐殖质的形成和分解、植物营养元素的转化等过程中起着不可替代的作用［9］。张婷等［10］将枯草芽孢杆菌Bacillus sub-tilisB006与淡紫拟青霉（P.lilacinus）Str.NH-PL-03施用于设施黄瓜连作土壤中，发现根际土壤由“真菌型”病土向“细菌型”健康土转变。尹淑丽等［11］通过施用不同生防菌研究了黄瓜不同生育时期根际土壤中微生物数量的动态变化，结果表明，接种细菌D和放线菌317的处理可提高根际土壤中细菌的数量，降低真菌的数量，对放线菌数量的影响不明显。这些证据表明运用菌株发酵液来影响植物根系土壤微生态环境是可行的。因此，本实验设计并实施了以根结线虫和微生物为检测对象的黄瓜盆栽试验，采用传统的稀释平板法计数土壤中三大类微生物，淘洗-过筛-蔗糖离心法分离土壤根结线虫并计算虫口减退率，旨在探明海洋枝顶孢霉BH0531对土壤根结线虫指数和土壤微生物的微生态效应，为进一步的应用研究提供实验依据，并为开发具有自主知识产权的新型安全杀线虫生物制剂提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1供试菌株和材料

海洋枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531，菌种保藏号CGMCC-5445，由天津师范大学生命科学学院微生物实验室提供；黄瓜根结线虫（Meloidogynespp.）二龄幼虫J2：取自天津市宝坻区黄瓜大棚基地；供试黄瓜品种为新津春四号：天津市黄瓜研究所。

1.1.2培养基

（1）活化培养基：去皮马铃薯200 g/L煮汁，20 g/L葡萄糖，20 g/L琼脂。

（2）发酵培养基：去皮马铃薯200 g/L煮汁，20 g/L葡萄糖，pH值自然。

（3）大麦仁培养基：10 g大麦仁，8 mL去离子水，浸泡3～6 h，灭菌。

（4）牛肉膏蛋白胨培养基：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，20 g/L琼脂，pH 7.4～7.6。

（5）马丁孟加拉红培养基：5g/L蛋白胨，10g/L葡萄糖，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，3.3g/L孟加拉红，20g/L琼脂，pH值自然。

（6）改良高氏一号培养基：20 g/L可溶性淀粉，0.5 g/L NaCl，1 g/L KNO3，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeSO4·7H2O，20 g/L琼脂，pH 7.2～7.4。

1.1.3化学试剂

葡萄糖：天津市凤传化学试剂有限公司；琼脂：天津市珠海卫生材料厂；孟加拉红、牛肉膏、可溶性淀粉：天津市化学试剂一厂；蛋白胨：浙江玉环红星生化制品厂；NaCl：天津市塘沽化学试剂厂；KH2PO4：天津市化学试剂六厂；FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O：西安化学试剂厂；KNO3：天津市化学试剂三厂。实验所用主要化学试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

SW-CJ-1F超净工作台：苏州净化设备厂；Leica DME光学显微镜：上海徕卡显微系统有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HZ-2010K控温摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；YXQG02型电热式灭菌锅：山东新华医疗器械厂；LDS-10离心机：北京医用离心机厂。

1.3试验方法

1.3.1发酵滤液的制备

BH0531菌株的活化：将保藏的BH0531菌种接种至活化培养基斜面试管，26℃培养5～7 d。

种子液的制备：取新培养的菌株斜面，加入无菌水洗下孢子，制备成106个/mL的孢子悬液。

发酵液的制备：以2%接种量接入装有100 mL液体发酵培养基的500 mL三角瓶中。26℃、120 r/min培养4 d。将培养好的菌液1 000 r/min离心去菌体，再经孔径为0.22 μm微孔滤膜真空抽滤，即为发酵滤液。

1.3.2黄瓜根结线虫二龄幼虫（J2）悬浮液的制备

将大田取得的黄瓜病根剪成1 cm小段；在1%次氯酸钠溶液中漂洗4min，再在匀浆机里搅拌2min；利用100目、300目和500目的网筛冲洗并收集虫卵。再将卵收集到的离心管中，在底部加入40%蔗糖溶液，3 500 r/min密度梯度离心5 min。之后吸取界面溶液过500目网筛，反复冲洗收集卵。将上述收集得到的卵置于已消毒的培养皿中，垫上湿润滤纸，25℃条件下孵化4 d。

1.3.3发酵液处理对黄瓜栽培土壤中根结线虫指数和减退率的影响实验

将黄瓜籽消毒催芽后，在穴盘中育苗，待黄瓜苗长至两叶一心期时定植。所用土壤为大田土∶泥炭土∶沙子=4∶4∶1。移栽后每盆使用发酵液40 mL灌根处理，1 d后接入配制好的线虫悬浮液。将所获发酵液配制成以下3个浓度梯度：原液稀释一倍、原液、原液浓缩一倍（对应干物质含量分别为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL），并按表1处理进行实验，每个处理重复3次，共24盆，随机排列。分别于处理15 d后计算线虫减退率。

表1 试验设计与处理Table 1 Design and treatment of experiments

1.3.4分析测定方法

（1）杀线率的测定

将所获发酵原液分别稀释和浓缩1倍，以无菌水为对照，以黄瓜根结线虫（J2）为靶标，进行杀线虫活性测定。取96孔板，每孔加入靶标线虫悬液20 μL（约200条），再分别加入200 μL发酵液的原液、1倍稀释液、1倍浓缩液，每个处理3次重复，25℃条件下培养，分别于3 d和5 d后于显微镜下观测线虫死亡情况，线虫校正死亡率计算公式如下：

（2）线虫减退率

土壤根结线虫分离采用淘洗-过筛-蔗糖离心法［12-13］。线虫减退率计算公式如下［14-15］：

（3）不同处理土壤中可培养微生物的测定

采用传统的稀释平板法测定可培养微生物数量，细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌培养采用马丁孟加拉红培养基（临用前每300 mL加入25%的乳酸3～4滴），放线菌培养采用改良高氏一号培养基（临用前每100 mL加入1%重铬酸钾1 mL）。微生物计数均计3个重复。每毫升样品中菌落形成单位数=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×5［16］。

1.3.5数据处理

应用Origin8.0软件对结果进行统计分析。

2　结果与分析

2.1发酵液杀线活性的测定

以无菌水作为对照（CK），对不同浓度的BH0531菌株发酵液进行了杀线虫活性的测定，结果见表2。由表2可知，在给定质量浓度范围内，发酵液对根结线虫二龄幼虫都具有明确的杀线活性，其作与浓度呈正相关；其中浓缩一倍的发酵液杀线率最高，3 d和5 d的校正死亡率分别达到93.7%和96.2%，均在A级（杀线率≥90%）以上。结果表明，3 d和5 d之间的杀线活性并无显著差异，但线虫死亡率呈现出持续升高的现象，表明发酵液的杀线活性具有时间延续性，并维持在较高的水平。

表2　菌株BH0531不同浓度发酵液对根结线虫二龄幼虫的杀线活性Table 2 The nematicidal activity of strain BH0531 different concentration fermentation liquid on root-knot nematodes J2

2.2发酵液对土壤中根结线虫指数的影响

以无菌水作为对照（CK），土壤中根结指数和线虫减退率于处理后第15天进行了测定，结果见表3。由表3可知，施药15 d后，3个浓度梯度处理条件下土壤线虫数明显减退，尤其是2个较高浓度条件下的线虫减退率＞50%，分别达到66.67%和71.21%。这一结果同表2结果有一致性，即杀线活性与发酵液的质量浓度呈正相关。相对而言，对照实验的线虫数不但没有减退，反而略有增加，说明土壤中根结线虫的减退是发酵液作用的结果，进一步明确了BH0531菌株发酵液对根结线虫的防治作用。

表3　生物杀线剂对土壤根结线虫二龄幼虫的防治效果Table 3 Control effect of bio-nematicide on root-knot nematode J2

2.3BH0531发酵液对土壤中可培养微生物数量的影响

2.3.1对根际土壤中可培养细菌数量的影响

图1　发酵液处理20 d（A）及50 d（B）对土壤细菌数量的影响Fig.1 Effect of fermentation liquid treatment 20 d（A）and 50 d（B）on amount of bacteria in soli

由图1（A）可知，处理20 d后的土壤中未加线虫组土壤中的细菌数量整体上呈现递增趋势，表明发酵液对细菌数量有一定的促进作用。与未加线虫组相比，加线虫组细菌数量明显减少，说明线虫的存在与细菌数量之间存一定的负相关性。由图1（B）可知，处理50 d后的土壤中细菌数量整体少于处理20 d后数量，其中1倍浓缩液处理50 d时加线虫组的细菌数量较处理20 d土壤细菌数量减少了41.44%。此外，加线虫组土壤细菌数量虽然整体上低于未加线虫组，但在组内（与对照相比）仍然呈现出随着发酵液浓度的提高而增加的趋势，特别是20 d的测定结果更加明显，且加线虫组与未加线虫组组内均存在显著性差异（P＜0.05）。尽管发酵液处理50 d后，高浓度（1倍浓缩液）处理的细菌数量有所降低，但仍较同组对照高出43.37%。这种时间上的减退效应可能与营养物的消耗和高浓度条件下导致线虫高死亡率所产生的物质有关。因此，发酵液在整体上对土壤中细菌的数量具有促进作用。

2.3.2对根际土壤中可培养放线菌数量的影响

由图2可知，未加线虫组土壤中的放线菌数量均比加线虫组数量多，50 d时加线虫组与未加线虫组细菌数量存在差异显著性（P＜0.05）。这一结果与细菌的测定结果相一致，在对照组中，未加线虫组土壤比加线虫组土壤放线菌数量分别增加为52.78%和53.27%。处理50d和20d后的土壤放线菌数量加线虫组合未加线虫组差异不显著（P＜0.05）。值得注意的是发酵液对放线菌的促进作用未表现出明确的浓度梯度相关性。同时，发酵液对放线菌数量的影响同样存在着时间上的减退效应。

图2　发酵液处理20 d（A）及50 d（B）对土壤放线菌数量的影响Fig.2 Effect of fermentation liquid treatment 20 d（A）and 50 d（B）on amount of actinomycetes in soli

2.3.3对根际土壤中可培养真菌数量的影响

由图3可知，发酵液处理50 d后的土壤中真菌数量显著少于处理20 d后真菌数量并且同样观察到时间效应。不同的是发酵液对土壤真菌数量显示出高浓度抑制效应。发酵液处理20 d后，随着发酵液浓度的提高，加线虫组土壤真菌数量也随之增加；而未加线虫组的土壤真菌数量在高浓度时却出现了负增长（-33.72%），明显不同于细菌和放线菌的结果。发酵液处理50 d后，高浓度发酵液表现出对真菌的抑制作用。尤其是未加线虫组在整体上低于加线虫组真菌数量，明确表现出对土壤真菌数量的抑制作用，且未加线虫组处理20 d和50 d之间存在差异显著性（P＜0.05）。

图3　发酵液处理20 d（A）及50 d（B）对土壤真菌数量的影响Fig.3 Effect of fermentation liquid treatment 20 d（A）and 50 d（B）on amount of fungus in soli

3　结论

海洋来源的枝顶孢霉（Acremniumsp.）BH0531是一株以松材线虫为靶标筛选出的生防菌，其一倍浓缩液对根结线虫的杀线率也达到了A级以上，具有较高的杀线活性。研究结果表明，菌株BH0531发酵液在室内离体条件下，对根结线虫的杀线作用拿到对土壤中的微生物数量和类群有明显的影响，表现出对细菌和放线菌的促进作用，以及对土壤真菌的抑制作用。因此，菌株BH0531发酵液可以通过使根际土壤由“真菌型”病土向“细菌型”健康土转变，以实现对植物“促长、防病”的作用。虽然可培养微生物占土壤微生物总量的比例不足1%［17］，但土壤中可培养微生物可能是对土壤生态系统贡献最大的类群。

此外，菌株BH0531发酵液对土壤根结线虫指数有明显的控制效应，在两个较高浓度条下的线虫减退率分别达到66.67%和71.21%，可以有效提高线虫减退率，降低虫口密度，拮抗因线虫的存在导致的土壤微生物数量降低，从而实现对黄瓜根结病的防治作用。充分表明该菌株是很有发展前途的线虫生防因子，为防治黄瓜根结线虫病、发展无公害蔬菜开辟一条新道路。当然，菌株BH0531发酵液能否从根本上改善连作土壤中微生物群落结构变化，使连作土壤中有益微生物增多，有效控制线虫指数，以及在规模栽培条件下防效如何还需要进一步探究验证。

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Micro-ecological effects of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on control of cucumber root-knot nematode

HUANG Min1，LIU Xiaoxia1，SHEN Peijuan1，CAI Shuang1，FENG Xin1，2，MENG Qingheng1，2*，SUN Jianhua1，2
（1.College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin 300387，China）

Thein vitronematicidal efficiency of fermentation liquid of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on root-knot nematode was determined.The effects of potting experimental conditions on the index and decreasing rate of nematodes and microorganism amount in soli were analyzed.The results showed that when the fermentation liquid was concentrate 1 time，the corrected death rate of the root-knot nematode was up to 96.2%，and the decreasing rate of nematodes was 71.21%.The fermentation liquid had promoting effect of bacteria and actinomycetes count in the soil，and bacteria and actinomycetes count were 1.24×108CFU/ml and 1.56×106CFU/ml，respectively.But it had inhibiting effect on fungus at high concentration，and the amount of fungus was decreased from 3.12×104CFU/ml to 8.67×103CFU/ml.However，the promoting effect decreased as time went by，but the inhibiting effect was undiminished.The control effect of strain BH0531 fermentation broth on cucumber root-knot nematode was effective by micro-ecological effects，such as nematicidal effect，promoting the growth of bacteria and actinomycetes，decreasing amount of fungus in soli and so on.

marine-derivedAcremoniumsp.；cucumber root-knot nematode；decreasing rate of nematode；soil microorganism；micro-ecological effects

Q939.9；S432.4+5

0254-5071（2016）03-0052-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.012

2016-01-05

国家自然科学基金资助项目（31272019）；天津市自然基金联合项目（15JCYBJC51400）

黄敏（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物的活性物质。

孟庆恒（1963-），男，副教授，研究方向为应用微生物。