超声波辅助提取白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸工艺研究

王欢，黄嫣，吴莹，李希，，冯建安，王佳

·炮制制剂·

超声波辅助提取白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸工艺研究

王欢1，黄嫣2，吴莹1，李希1，2，冯建安2，王佳1

目的：优化并确定白花蛇舌草的最佳超声提取工艺。方法：采用L9（34）正交试验设计，考察超声提取工艺中乙醇浓度、溶剂用量及提取时间三个主要因素对齐墩果酸和熊果酸提取效率的影响。结果：超声提取的最佳提取条件为：用40 mL的100 ％乙醇超声提取30 min。结论：超声波辅助提取工艺稳定可行，可用于白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的提取。

白花蛇舌草；超声提取；正交设计；齐墩果酸；熊果酸

白花蛇舌草为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）的干燥全草［1］。我国大部分地区均有分布，主产于广西、广东。本品具有清热解毒，消痈止痛之功效，常主治痈疮毒、咽喉肿痛、毒蛇咬伤及热淋［2］。现代药理表明该药具有抗菌、消炎、抗肿瘤、增强免疫功能，临床上广泛用于各类肿瘤，如肺癌、直肠癌，肝癌，胃癌等［3］。白花蛇舌草中主要含有蒽醌类、萜类、黄酮类、甾醇类、烷烃类、有机酸类、多糖类、生物碱、白花蛇舌草素、强心苷等成分，还含有一些微量元素、氨基酸及挥发性成分［4］。其中有机酸类齐墩果酸（OA）和熊果酸（UA）为其活性成分，二者互为五环三萜类同分异构体，其中OA具有消炎和抑菌，降转氨酶保肝作用，UA有抗糖尿病、抗溃疡及降低血脂的作用，对多种致癌、促癌物有抵抗作用，对多种恶性肿瘤细胞有抑制生长作用［5］。

白花蛇舌草中OA和UA的提取多采用醇提，超声波辅助同时提取OA和UA的报道研究甚少。超声波提取是利用超声波具有的机械效应、空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取中药的有效成分。超声波辅助提取具有提取效率高，时间短，适应性广，成本低，操作简单易行等优点。本文拟采用超声法从白花蛇舌草中提取OA和UA，用正交试验设计法对其工艺条件进行研究，以确定白花蛇舌草的最佳提取工艺。

1 材料与仪器

白花蛇舌草药材（购自四川省新荷花中药饮片股份有限公司，产地：四川，批号：1403020），齐墩果酸对照品（OA，中国食品药品检定研究院，批号：110709-201206），熊果酸对照品（UA，中国食品药品检定研究院，批号：110742-201220），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），三乙胺（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），水为超纯水（实验室自制），其余试剂均为分析纯。

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），DAD检测器（美国安捷伦科技有限公司），KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BT 125D型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），艾科浦分析型AUP-2-35G-1实验室纯化水机（颐洋企业发展有限公司）。

2 方法与结果

2.1色谱条件

Spursil C18色谱柱（4.6 ×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90：10：0.03：0.06），流速0.5 mL·min-1，柱温35 ℃，检测波长210 nm，进样量10 μL。对照品和供试品色谱图如图1所示。

图1　对照品和供试品色谱图

2.2溶液的制备

对照品溶液的制备 精密称取OA和UA对照品适量，用甲醇分别配制成含OA1.08 mg·mL-1，UA2.12 mg·mL-1的对照品储备液，精密量取对照品储备液适量制成含OA0.108 mg·mL-1，UA0.424 mg·mL-1的对照品混合溶液。

供试品溶液的制备 准确称取白花蛇舌草粉末约1.00 g， 置于100 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL100％乙醇溶液，超声提取30 min，过滤，水浴蒸干，取适量甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3方法学考察

2.3.1标准曲线与线性范围 取对照品混合溶液，梯度稀释，得OA浓度为108，54，27，13.5，6.75，3.375 μg·mL-1，和UA浓度依次424，212，106，53，26.5，13.25 μg·mL-1的一系列对照品混合液。分别精密吸取对照品混合溶液10 µL，按上述色谱条件进行测定，以对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得OA和UA的回归方程分别为Y=15.042 9X+8.1005（R2=0.999 8），Y=10.056 8X+16.582 6（R2=0.999 5），线性范围分别为3.375～108 μg·mL-1，13.25～424 μg·mL-1。

2.3.2精密度 精密吸取对照品溶液10 μL，按上述色谱条件重复进样6次，计算OA和UA的峰面积RSD分别为1.57％，0.79％，表明仪器精密度良好。

2.3.3重复性 取同一批白花蛇舌草样品，制备6份供试品溶液，分别进样分析，记录OA、UA的峰面积，计算含量。OA、UA的含量平均值分别为0.498 7，2.214 4 mg·g-1，RSD分别为2.12％，1.97％。结果表明，本方法的重复性良好。

2.3.4稳定性 分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，于0，2，4，8，12，24 h时进行测定，以OA和UA的峰面积计算RSD，结果OA和UA的RSD分别为1.75％、1.13 ％，表明在24 h内对照品和供试品稳定性良好。

2.3.5加样回收率 精密称取白花蛇舌草样品约0.3 g，按供试品含量的80％，100％，120％，精密加入相应的对照品溶液，每种浓度平行3份，测定含量，计算平均回收率及RSD，见表1。

表1　OA和UA加样回收率试验结果

2.4超声提取条件的考察

2.4.1提取溶剂的考察 根据OA和UA易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮，不溶于水的理化性质，考察不同的提取溶剂对提取结果的影响。精密称定白花蛇舌草粉末2.00 g，分别加入60 mL乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮，超声提取60 min，过滤，水浴蒸干，取适量甲醇溶解并转移至25 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液10 μL进样分析。由试验结果可知，采用甲醇、乙醇、丙酮提取率较高，考虑到溶剂的安全性及原料成本问题，最终采用乙醇作为提取溶剂。

表2　提取溶剂考察试验结果

2.4.2正交试验 本试验采用正交设计方法，以提取液中OA和UA含量的综合评分作为评判指标，乙醇浓度（A）、溶剂用量（B）和提取时间（C）为考察因素，每个因素设计3个水平，选择 L9（34）进行试验，各因素的水平设计见表3。

表3　L9（34）因素水平表

准确称取白花蛇舌草药材约1.00 g，按L9（34）正交设计表中各试验条件进行超声提取，收集提取液，过滤，水浴蒸干，取适量甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。并按前述色谱条件进行测定，采用DPS数据分析系统进行方差分析，结果见表4。

表4　L9（34）正交实验结果

注：综合评分=（OA含量/最大OA含量×0·5+UA含量/最大UA含量×0·5） ×100

表5　正交设计方差分析表（完全随机模型）

直观方差分析结果可知，三个因素的影响大小顺序为A＞B＞C，即乙醇浓度为最大影响因索，其他依次为乙醇用量和提取时间，其中，A和B因素有显著性差异。根据极差分析C2＞C1＞C3，综合考虑提取液中OA和UA的含量越高，白花蛇舌草的提取工艺越理想，因此，C因素选取提取时间较短且OA和UA含量较高的水平，白花蛇舌草中OA和UA的最佳提取工艺为A3B3C2，即40 mL100％乙醇超声提取30 min。

2.4.3验证试验 为进一步考察优选工艺，以所得最佳工艺条件提取3批白花蛇舌草样品，测得提取液中

OA和UA的含量结果见表6。

表6　验证试验结果

3 讨论

采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，在190-400 nm下对对照品和供试品进行全波长扫描，结果显示在在205 nm处，OA和UA有最大吸收，考虑到溶剂峰的影响，最终确定210 nm作为检测波长。实验中曾采用甲醇-水系统作为流动相，加入少量醋酸调节pH，结果保留时间长，拖尾严重，且pH值对分离度的影响较敏感。在参考文献的基础上［5］，采用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺系统，既改善了峰形，保留时间也相对减少了。分别考察了不同的流速1，0.8，0.6，0.5 mL·min-1，结果表明流速快，出峰时间早，但分离度差，低流速能提高OA和UA间的分离度，最终选择流速为0.5 mL·min-1。对于不同的柱温，温度越高，出峰时间也短，峰形好但分离度差，通过对不同的柱温20，25，30，35，40 ℃的考察，综合考虑，选择35 ℃。

超声提取具有高效、快速、节能、环保等特点，本实验通过考察影响超声提取的各个因素，最终确定了白花蛇舌草的最佳超声提取工艺为40 mL体积分数为100％的乙醇，提取30 min。白花蛇舌草中化学成分复杂，缺乏系统性研究，指标性成分或有效成分对照品的制备及含量测定指标尚未建立，本研究以OA和UA为指标成分，对白花蛇舌草的含量测定的建立具有一定的指导意义。

［1］ 四川省食品药品监督管理局.四川省中药材标准［S］.成都：四川科学技术出版社，2010，180-182.

［2］ 吴柏林，徐燕.白花蛇舌草抗肿瘤药理研究近况［J］.现代中西医结合杂志，2008，17（9）：1451-1452.

［3］ 孙岩，李洁.白花蛇舌草抗肿瘤作用的研究进展［J］. 食品与药品，2012（5）：210-211.

［4］ 覃骊兰，邓家刚.中药白花蛇舌草化学成分及有效成分药理活性的研究进展［J］. 内蒙古中医药，2008，27（4）：42-45.

［5］ 周先明，吕美红.高效液相色谱法测定中草药中齐墩果酸熊果酸含量的应用进展［J］. 安徽医学，2011，32（11）：1950-1951.

（责任编辑：傅舒）

Ultrasonic assisted extraction of oleanolic acid and ursolic acid from Baihuasheshecao/

WANG Huan1， HUANG Yan2， WU Ying1， LI Xi1， 2， FENG Jian-an2， WANG Jia1//（1.School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan； 2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences， Institute of TCM， Chengdu 610031， Sichuan）

Objective: To optimize the ultrasonic extraction conditions of Baihuasheshecao. Method: The concentration of ethanol， ratio of material to liquid， ultrasonic time， which effected the extraction efficiency of oleanolic acid and ursolic acid，were evaluated by L9（34） orthogonal experiment design. Result: The best extraction conditions were： ultrasonic extraction 30 min with 40 mL 100％ ethanol. Conclusion: The ultrasonic assisted extraction process is stable and feasible， which can be used for extracting oleanolic acid and ursolic acid from Baihuasheshecao.

Baihuasheshecao； ultrasonic extraction； orthogonal experiment design； oleanolic acid； ursolic acid

R 284.2

A

1674-926X（2016）03-010-04

四川省省级公益性科研院所基本科研项目（14-4-422）

1.成都中医药大学药学院，成都 611137 2.四川省中医药科学院中医研究所，成都 610031

王欢，女（1989-），在读硕士研究生，从事中药新制剂、新技术、新工艺的研究Tel：18380228305 Email：928451725@qq.com

李希，女（1969-），硕士，教授，从事中药新制剂、新技术、新工艺的研究工作Tel：18030897734 Email：1836820767@qq.com

2015-06-30