半夏泻心汤对高龄合并D-半乳糖诱导衰老模型大鼠的影响

李利民，潘嘉，刘洁，宁楠，黄利，邓延莉，于娅，张吉仲

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半夏泻心汤对高龄合并D-半乳糖诱导衰老模型大鼠的影响

李利民1，潘嘉1，刘洁1，宁楠1，黄利1，邓延莉1，于娅1，张吉仲2

目的：研究半夏泻心汤对衰老模型大鼠学习记忆能力和脑内神经递质的影响。方法：高龄大鼠ip D-半乳糖125 mg·kg-1，每天1次，连续4周造成衰老模型动物，用水迷宫检测衰老大鼠学习记忆能力，用Elisa法检测脑组内多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）和五羟色胺（5-HT）等的含量，用Elisa法检测血清降钙素相关基因肽（CGRP）、内皮素-1（ET-1）的水平，用免疫组织化学方法检测脑组织内脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。结果：半夏泻心汤给药组可明显缩短逃避潜伏期；半夏泻心汤10和5 g·kg-1给药组海马区脑组织内DA和5-HT含量明显升高，可明显上调脑组织额叶皮层区BDNF的表达，但半夏泻心汤对血清CGRP和ET-1未见明显影响。结论：半夏泻心汤对衰老模型大鼠脑内单胺类神经递质水平与额叶皮层BDNF的表达有显著影响。

半夏泻心汤；衰老大鼠；单胺类神经递质；脑源性神经营养因子

痴呆是一种以认知功能缺损为核心症状的获得性智能损害综合征，通常累及老年人，65岁以上的老人大约有7.8％患痴呆，年龄越大，危险性越高［1］。半夏泻心汤始见于《伤寒论》，具有辛开苦降，和中消痞之功，临床主要用于治疗寒热互结，气机壅滞之痞证，如溃疡性结肠炎、胃癌等。我们在过去的研究中，发现半夏泻心汤对脾虚大鼠脑组织内单胺类神经递质有调节作用［2］，而脑组织内各种单胺类神经递质是记忆形成和保持不可缺少的环节之一，老年痴呆又以认知功能缺损为核心症状，故而推测半夏泻心汤可能对老年痴呆治疗有一定作用。为了验证上述设想，为临床治疗痴呆提供实验依据，我们进行了半夏泻心汤对衰老模型大鼠的影响实验，报告如下。

1 材料

1.1试验药物

半夏泻心汤各组成药物均购自四川省中药饮片有限责任公司，其中炙甘草产于新疆，黄芩产于河北，人参产于东北，干姜产于四川，黄连产于四川，法半夏产于四川，以上药物均执行2010年国家药典标准，大枣产于新疆（自配）。按照生药剂量比例根据文献折算给药量，依照人单位体重生药量求得大鼠单位体重生药量，并扩大5倍。全方由半夏12 g，干姜9 g，黄芩9 g，黄连3 g，人参9 g，甘草9 g，大枣4枚组成，精确称取上述相应剂量的生药，加入10倍量清水浸泡30 min（人参提前浸泡24 h），常规煎煮2次，30 min/次，100目滤布过滤药液，2次滤液混合后，60℃水浴加热浓缩为每1 mL药液含1 g生药的提取药液供给药用。

石杉碱甲片（哈伯因），河南太龙药业股份有限公司。规格与包装：50 µg/片×24片/盒，产品批号：130904，有效期至：2015/08。

1.2动物

SD 大鼠，SPF级，120只，全雌，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（川）2013-19号，所有动物于室温18～22℃，相对湿度40％～70％，12h明暗交替环境中饲养至15月龄后进行实验。另取6月龄大鼠20只作为对照组。

1.3试剂

大鼠降钙素相关基因肽（CGRP）、内皮素-1 （ET-1）Elisa试剂盒，上海西唐生物科技公司；D-半乳糖，上海金穗生物科技有限公司；Rat Dopamine （DA） ELISA Kit，Rat Noradrenaline （NE） ELISA Kit；，Rat 5-hydroxy tryptamine （5-HT） ELISA Kit均为USA MyBioSource， Inc出品；抗大鼠抗体脑源性神经营养因子（ brain derived neurotrophic factor，BDNF），多聚体抗兔IgG-HRP，DBA染色试剂盒等，均由武汉博士德生物工程有限公司出品。

1.4仪器

光谱扫描式多功能读数仪，Thermo Fisher。酶标仪，洗板机，Denly Dragon；Discovry XT全自动免疫组化染色系统，Roche；Y型水迷宫，自制。

2 方法

2.1动物造模［3， 4］与分组

实验动物适应1周后，Y型水迷宫实验筛选动物，剔除学习记忆能力未明显下降动物后，将动物随机分成5组，每组10只：模型组，大、中、小剂量给药组和石杉碱甲组；另取6月龄大鼠10只作为青年对照组。对照组皮下注射生理盐水5 mL·kg-1，其余各组均皮下注射D-半乳糖125 mg·kg-1每天1次，连续4周。然后对照组和模型组灌胃生理盐水10 mL· kg-1，给药组分别ig给药，连续6周。给药最后一周进行历时1周的Y型水迷宫实验。 实验过程中每周称重一次，以便及时调整给药量。

2.2Y型水迷宫对实验动物学习记忆能力的测试

采用 Y 型水迷宫实验监测大鼠学习记忆能力，记录大鼠平均逃避潜伏期（从入水起点至寻找到阶梯出水的时间）和正确反应次数（以10s内直接抵达平台为正确反应）［5］，预训练2 d，每天2次，每次训练时间定为2 min，2 min仍未找到安全通道者以120 s计算；正式测试3 d，每天1次，每次测试时间定为2 min，2 min仍未找到安全通道者以120 s计算。

2.3大鼠海马DA、NE和5-HT含量的测定

参照文献［6］的方法 ，学习记忆测试结束后1 h，将动物切断股动脉放血处死，迅速取脑，置于冰盒上，取出大脑，分离左侧海马区，脑组织称重，按照重量和体积比1∶10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆，4℃，3500 r·min-1，离心10 min，取上清立即测定。采用Elisa方法DA、NE和5-HT含量，严格按试剂盒说明书进行。

2.4大鼠血清CGRP和ET-1含量的测定

取血后，3000 r·min-1离心10 min，取血清，采用Elisa方法测血清CGRP和ET-1含量，严格按试剂盒说明书进行。

2.5用免疫组织化学法测定大鼠额叶皮层BDNF的表达

学习记忆测试结束后1 h，将动物切断股动脉放血处死，迅速取脑，置于冰盒上，取出大脑，迅速放入4％多聚甲醛固定液中，2 d后分离右侧海马和皮层，常规石蜡包埋、切片、Roche全自动免疫组化染色系统染色。应用彩色病理图文分析系统获得高清晰的免疫组化染色病理图片。使用Image Pro Plus7.0分析测量BDNF的表达面积（Area）和累积光密度（IOD），用非参数法进行统计学分析。

3 结果

3.1Y型水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力

实验动物造模后，AD模型大鼠在水迷宫的逃避潜伏期较青年对照组明显延长；与模型组比较，在训练后24、48和96 h测定，半夏泻心汤给药组能明显缩短逃避潜伏期（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。

表1　半夏泻心汤对大鼠逃避潜伏期的影响

注：与模型组比较，* P＜0.05， ** P＜0.01

3.2半夏泻心汤对海马区DA、NE和5-HT含量的影响

与青年对照组比较，模型组动物海马区组织内DA和5-HT含量明显降低（P＜0.01），NE含量也有一定降低，但NE含量的降低，与对照组比较并无统计学意义。与模型组比较，半夏泻心汤给药后，大、中剂量组海马区脑组织内DA和5-HT含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01），石杉碱甲可升高海马脑组织DA含量。结果见表3。

表3　半夏泻心汤对海马区DA、NE和5-HT含量的影响

3.3半夏泻心汤对血清CGRP和ET-1的影响

与青年对照组比较，模型组动物血清CGRP含量明显升高，ET-1含量也有一定升高，但ET-1含量的升高，与对照组比较并无统计学意义。与模型组比较，半夏泻心汤给药后，血清CGRP和ET-1含量未见明显改变，石杉碱甲可降低血清ET-1含量（P＜0.05）。结果见表4。

表4　半夏泻心汤对血清CGRP和ET-1的影响

3.4半夏泻心汤对额叶皮层BDNF表达的影响

与青年对照组比较，模型大鼠脑组织皮层区BDNF表达的Area和IOD较青年对照组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，半夏泻心汤10 g·kg-1和5 g·kg-1给药组BDNF表达Area和IOD明显上调（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图1。

图1　半夏泻心汤（bxxxt）对大鼠脑组织额叶皮层BDNF表达的影响

4 讨论

已有研究证实D-半乳糖衰老模型具有与人类自然衰老相似的生化改变、免疫功能低下、基因表达与调控异常、细胞生长繁殖能力下降、细胞退行性改变及认知障碍［7］等表现。学习记忆能力与单胺类神经递质DA、NE、5-HT及神经肽密切相关，它们之间相互制约处于一种平衡状态［8］。研究表明，NE在记忆保持方面起重要作用，而改善记忆与促进DA释放有关，5-HT系统则参与调节情绪、动机和食欲等［9～10］。神经递质NE、DA、5-HT等由神经细胞合成后储存于囊泡内，当动作电位到达神经末梢时，在Ca2+的参与下以胞吐的方式到达突触间隙，发挥作用后通过酶解或再摄取被迅速清除。在正常情况下，中枢内神经递质的分泌保持在一定水平，并且它们相互之间的比例协调，从而维持功能的稳定；随着机体的老化，会出现学习记忆能力的下降，同时脑内单胺类神经递质的代谢亦发生紊乱，出现NE、DA、5-HT含量的下降，提示衰老过程中脑内单胺类神经递质的平衡遭到破坏，并与一些老年性疾病如老年痴呆及脑功能的减退有关［11～12］。

在AD的发病过程中，突触功能的紊乱通常早于突触和神经细胞数量的减少。在AD中晚期，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在调节突触可塑性方面扮演了很重要的角色。因此，BDNF与AD的关系受到了广泛的瞩目。

BDNF还可以增强神经递质的释放，可能是阻止了持续高频刺激引起的突触劳损［13］。

本项研究发现：半夏泻心汤能明显缩短衰老模型大鼠在水迷宫中的逃避潜伏期，可增加脑组织中多巴胺（DA）和5羟色胺（5-HT）含量，还可提高额叶皮层BDNF的表达。但对血清CGRP与ET-1的水平无明显影响。分析半夏泻心汤可能对脑组织中单胺类神经递质有一定的调节作用，使衰老过程中脑内单胺类神经递质的遭到破坏平衡状态得到改善，同时增加BDNF表达，改善了神经递质的释放，从而提高了衰老大鼠学习记忆能力。

［1］ 田金洲.中国痴呆诊疗指南［S］.北京：人民卫生出版社，2012：1.

［2］ 张吉仲，李利民，黄利，等.半夏泻心汤及其拆方对脾虚大鼠下丘脑中多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺的影响［J］.华西药学杂志，2014，29（3）： 286.

［3］ 龚国清，徐黻本.小鼠衰老模型研究［J］.中国药科大学学报，1991，22（ 2）：101.

［4］ 朱亚珍，朱虹光. D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法［J］. 复旦学报（医学版）， 2007，34 （4）：617.

［5］ 黄丽萍，熊玉洁，赵梦岚，等. 覆盆子对肾阳虚型AD大鼠学习记忆的影响［J］.中药药理与临床，2013，29（4）：111.

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［8］ 厚华刚，库保善.胆碱系统和其它神经递质/调质系统在学习记忆中的作用及相互作用［J］.包头医学院学报，1998，14 （3）： 79.

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（责任编辑：陈思敏）

Effect of Banxiaxiexin Tang on aging rats induced by elderly merger D-galactose/

LI Li-min1， PAN Jia1， LIU Jie1， NING Nan1， HUANG Li1， DENG Yan-li1， YU Ya1， ZhANG Ji-zhong2//（1. Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610041， Sichuan； 2. Ethnic Medicine Institute， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， Sichuan）

Objective: To observe the influence of Banxiaxiexin Tang on learning and memory and neurotransmitters in aging model rats brain. Method: Elderly rats were subcutaneous injected of D-galactose 125 m g·kg-1， once a day for 4 weeks to establish aging animal model. Learning and memory ability was measured with water maze. The content of dopamine （DA）， norepinephrine （NE） and serotonin （5-HT） in the brain were tested with Elisa assay. The serum levels of calcitonin gene-related peptide （CGRP） and endothelin -1 （ET-1） were tested with Elisa assay. Brain-derived neurotrophic factor （BDNF） expression was detected in brain tissue with immunohistochemical method. Result: The escape latency was significantly shorten in Banxiaxiexin Tang group. Compared with model group， the contents of DA and 5-HT in hippocampus area of Banxiaxiexin Tang group （10 and 5 g·kg-1dose） was significantly increased. Banxiaxiexin Tang can significantly increase the expression of BDNF in brain tissue of frontal cortex， but had no significant effect on the serum levels of ET-1 and CGRP. Conclusion: Banxiaxiexin Tang has a significant effect on the levels of monoamine neurotransmitter in brain and BDNF expression in the frontal cortex of brain in aging model rat.

Banxiaxiexin Tang； aging rats； monoamine neurotransmitter； brain-derived neurotrophic factor

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R 285.5

A

1674-926X（2016）03-016-03

四川省应用基础研究计划项目（2013JY0190）；四川省省级公益性科研院所基本科研业务专项（A-2014N-12， A-2015N-5）

1.四川省中医药科学院药理毒理所，四川 成都6100412；2.西南民族大学民族医药研究院，四川成都 610041

李利民，男，副研究员，主要从事中药药理毒理研究 Tel：13693496628 Email：llm_cd@163.com

张吉仲，男，副教授，主要从事中药、民族药复方药理与毒理研究和教学Tel：13540891169 Email：daowen2005@126.com

2015-05-08