小鼠慢性应激性抑郁症易感品系筛选及其机制初步研究

徐龙进， 王可洲（.山东省疾病预防控制中心， 济南 5004； .山东省实验动物中心， 济南 500）

小鼠慢性应激性抑郁症易感品系筛选及其机制初步研究

徐龙进1， 王可洲2
（1.山东省疾病预防控制中心， 济南 250014； 2.山东省实验动物中心， 济南 250011）

目的 筛选对慢性、轻度不可预见性应激（CUMS）敏感的小鼠品系，并初步研究其敏感机制。方法 选用KM、ICR、BABL/c、C57BL/6小鼠建立CUMS抑郁模型，通过体质量、糖水偏好、旷场实验得分考察不同品系小鼠对CUMS的敏感性。通过对小鼠海马组织糖皮质激素受体（GR）、5-羟色胺（5-HT）、犬尿氨酸（KYN）含量的测定， 对其易感机制进行初步研究。结果 造模后C57BL/6小鼠体质量、糖水偏好、旷场实验水平运动和垂直运动得分等指标均对CUMS表现出显著敏感性，BABL/c小鼠对糖水偏好、旷场实验水平运动和垂直运动得分较为敏感。对照组C57BL/6小鼠海马组织GR、KYN含量与其他三种小鼠存在显著差异。结论 在筛选的4个品系小鼠中，C57BL/6 小鼠对CUMS最为敏感，适于建立CUMS抑郁症动物模型，其敏感机制可能与海马组织GR、KYN含量有关。

小鼠； 慢性应激； 易感品系； 机制

抑郁症是一种以持久性情绪低落、言语减少为主要临床表现的精神疾病，近年来发病率呈升高趋势［1， 2］， 但发病机制尚未阐明。已建立的抑郁症模型包括孤养、应激、神经生化改变、转基因等［3］。每种模型造模的切入点不同，适用范围均有局限性，应激模型的造模机理及模型表现与人类抑郁症病因及临床症状相似。其中慢性轻度不可预见性应激（Chronic unpredicted mild stress， CUMS）模型被认为优于急性应激模型。然而，迄今为止国内外仍缺乏关于CUMS抑郁模型敏感动物品系选择及敏感机制的系统研究。

本研究选用4种实验常用的小鼠品系建立CUMS抑郁模型， 比较其对CUMS的敏感性， 并初步研究了其敏感机制，为模型动物的培育和改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级4周龄KM、ICR、BABL/c、C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2012-0001］， 体质量22±4 g， 雌雄各半，分笼饲养，环境温度20～22℃，相对湿度45%～60%， 12 h/12 h明暗循环［SYXK（鲁）2013-0008］，自由摄食摄水，检疫7 d后使用。连续3 d采用强迫游泳对小鼠的自发活动进行测定，将过于兴奋和过于安静的小鼠筛除。本实验方案经山东省疾病预防控制中心实验动物伦理委员会审核批准，实验动物饲养、实验操作均符合实验动物伦理要求。

1.2 仪器和试剂

JY10001型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）； DK-420S恒温水浴箱（上海双旭电子有限公司）；FYL-YS-150L医用4 ℃保冷柜（北京福意电器有限公司）； 自制旷场实验箱（81 cm×81 cm×50 cm， 顶部两组照明， 光照强度120 Lux， 内置摄像头， 监测动物的活动状态， 底部等分为16个等边方格）； 羊抗小鼠糖皮质激素受体（GR）抗体（美国Santa Cruz 公司， 批号I1306）； 小鼠5-羟色胺（5-HT） ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）； 小鼠犬尿氨酸（KYN）ELISA试剂盒（北京绿源大德生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 CUMS抑郁模型的建立 按照许晶等［4］方法稍作改进，将每种品系小鼠24只（雌雄各半）按照性别随机分为雄性对照组、雄性模型组、雌性对照组、雌性模型组， 每组6只。造模时间为3周，3周内随机安排9种刺激， 每日1种， 每种刺激使用3次， 9种刺激包括： 4 ℃冰水游泳5 min、明暗颠倒24 h、45 ℃热水游泳5 min、停食48 h、夹尾1 min、湿垫料24 h、束缚2 h、水平摇晃10 min、倾斜鼠笼24 h。

1.3.2 小鼠CUMS抑郁易感品系的筛选 通过体质量、糖水偏好实验、旷场实验考察小鼠对CUMS抑郁的敏感性。

1.3.2.1 体质量测量 造模后7 d、14 d、21 d、28 d上午9∶00～10∶00测量小鼠体质量。

1.3.2.2 糖水偏好实验 测量小鼠体质量后进行糖水偏好实验，持续时间为8 h，实验用液体每瓶200 mL。实验前3 d给予2瓶质量分数1%蔗糖水； 前2 d，给予1瓶1%蔗糖水和1瓶纯净水，每隔3 h调换水瓶位置； 前1 d，禁食禁水24 h。糖水偏好实验时给予每笼小鼠1瓶1%蔗糖水和1瓶纯净水。8 h后称重剩余量， 计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗， 计算糖水偏好指数。糖水偏好指数=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）。

1.3.2.3 旷场实验 造模后10 d、20 d分别进行2次旷场实验，每日9∶00～12∶00将小鼠置于底部中央方格，观察记录小鼠穿越格数（四肢踏入的方格方可计数，作为水平运动得分）和后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，作为垂直运动得分）。清洁旷场实验箱后再进行下一只小鼠的观察。通过水平运动得分（horizontal movement score）和垂直运动得分（vertical movement score）考察小鼠的自发性探索运动状态。

1.4 易感机制研究

分离小鼠海马组织， 测定生物标志物含量， 初步研究小鼠对CUMS抑郁的易感机制： 造模后28 d各组小鼠体质量、糖水偏好实验结束后，用质量分数20%乌拉坦麻醉小鼠，打开胸腔，生理盐水心脏灌流后断头处死小鼠、冰浴取全脑，分离海马组织，左右侧海马分别称重，-70 ℃保存备用。左侧海马用于GR蛋白表达测定，右侧海马用于5-HT、KYN的含量测定，以减少实验动物用量。

按照Lewis等［5］方法提取小鼠海马组织蛋白后，采用蛋白印迹法（Western blot） 测定小鼠海马内GR蛋白表达。

取小鼠海马组织按按质量体积比1∶9加入生理盐水，制成匀浆，7 000 r/min 离心取上清液，采用小鼠5- HT ELISA试剂盒和小鼠KYN ELISA试剂盒测定海马组织中5-HT、KYN的含量。

1.5 统计方法

采用SPSS12.0软件进行统计分析，数据以x-± s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠CUMS抑郁易感品系的筛选

2.1.1 小鼠体质量变化 CUMS抑郁模型建立后7 d、14 d、21 d、28 d测定小鼠体质量，详见表1。

2.1.2 糖水偏好实验 CUMS抑郁模型建立后7 d、14 d、21 d、28 d测定小鼠糖水偏好指数（表2），造模后14 d、21 d、28 d ICR小鼠、C57BL/6小鼠糖水偏好指数均极显著低于对照组（P＜0.01）。KM小鼠及雄性BABL/c小鼠在14 d糖水偏好指数显著低于对照组（P＜0.05），21 d、28 d极显著低于对照组（P＜0.01）。

2.1.3 旷场实验 CUMS抑郁模型造模后10 d、20 d分别进行2次旷场实验，测定小鼠水平运动和垂直运动得分（表3）。四种小鼠模型组20 d水平运动得分均显著低于对照组。C57BL/6小鼠雄性模型组水平运动得分极显著低于KM、ICR、BABL/c小鼠（P＜0.01）。四种小鼠20 d垂直运动得分均显著低于对照组。除雄性ICR小鼠外，各组小鼠造模后20 d垂直运动得分均显著或极显著低于10 d。模型组雌性C57BL/6小鼠垂直运动得分极显著低于KM、ICR、BABL/c模型小鼠（P＜0.01）； 模型组雄性C57BL/6小鼠垂直运动得分极显著低于KM、ICR、模型小鼠（P＜0.01）。

表1 不同品系小鼠CUMS后体质量变化 g

表2 不同品系小鼠CUMS后糖水偏好指数变化

2.2 易感机制研究

2.2.1 小鼠海马组织中GR蛋白表达测定结果 四种小鼠模型组海马组织中GR蛋白含量均显著或极显著高于对照组（表4）。其中， 雌性BABL/c小鼠显著高于C57BL/6小鼠（P＜0.05），其他小鼠均极显著高于C57BL/6小鼠（P＜0.01）。此外， C57BL/6小鼠对照组海马组织中GR蛋白含量显著或极显著低于其他三种小鼠。

2.2.2 小鼠海马组织中5- HT含量测定结果 除雄性KM小鼠外，其他小鼠模型组海马组织中5-HT含量均显著或极显著高于对照组（表5）。BABL/c小鼠模型组海马组织中5- HT含量显著高于C57BL/6小鼠，KM小鼠和ICR小鼠模型组海马组织中5-HT含量极显著高于C57BL/6小鼠。

2.2.3 小鼠海马组织中KYN含量测定结果 造模后28 d处死小鼠， 采用ELISA试剂盒测定小鼠海马组织中KYN含量， 结果见表6。四种小鼠模型组海马组织中KYN含量均显著或极显著高于对照组，其中雌性模型组小鼠海马组织中KYN含量极显著高于对照组（P＜0.01）。BABL/c、C57BL/6小鼠雌性和雄性模型组小鼠海马组织中KYN含量均极显著高于对照组（P＜0.01）。对照组C57BL/6小鼠海马组织中KYN含量显著或极显著高于其他三种小鼠模型组。

表3 不同品系小鼠CUMS后旷场实验得分

表4 小鼠海马组织中GR蛋白水平 ng/g

表5 小鼠海马组织中5- HT含量 ng/mL

表6 小鼠海马组织中KYN含量 ng/mL

3 讨论

CUMS是构建慢性抑郁症动物模型的方法之一。目前常用的模型动物为大鼠［6，7］，关于小鼠CUMS抑郁症模型的报道尚少，而有关小鼠CUMS抑郁症模型敏感品系及敏感机制的研究尚未见报道。目前普遍认为，CUMS抑郁症模型能够人类抑郁症的主要临床症状，如食欲减退、快感缺乏、活动兴趣降低等［8］。摄食量、体质量、糖水偏好及行为学表现（悬尾实验、迷宫实验、强迫游泳、旷场实验）等是常用的抑郁症动物模型评价指标和方法。因此，本研究通过CUMS建立小鼠慢性抑郁症模型，通过体质量、糖水偏好、旷场实验对模型小鼠的敏感性进行了考察。

CUMS小鼠抑郁症模型建立后雌性KM小鼠及雄性BABL/c小鼠体质量未见显著降低或出现显著升高（表1）， 而ICR小鼠、C57BL/6小鼠体质量显著降低， 说明体质量指标可能不适于作为小鼠抑郁症模型的评价指标。而临床抑郁症患者体质量变化也存在表现不一的问题， 体质量降低或升高现象均存在。国外对CUMS模型体质量增加或减少也尚存争议［9-11］。

糖水偏好实验可用于评价模型动物的快感缺失状态，是衡量快感缺乏的客观指标。CUMS小鼠抑郁症模型建立后四种小鼠糖水偏好均显著降低， 表现出相同的趋势，说明糖水偏好可作为小鼠抑郁症模型的评价指标。其中BABL/c小鼠、C57BL/6小鼠SP降低尤为显著， 提示BABL/c小鼠、C57BL/6小鼠对CUMS较为敏感。

水平运动用于反映动物的活动度（活动兴趣），垂直运动用于评价动物对新鲜环境的好奇程度（探知兴趣）， 两项指标均为精神类疾病动物模型的常用指标。本实验中造模10、20 d后四种小鼠水平运动及垂直运动得分均显著降低， 说明二者均可作为小鼠抑郁症模型的评价指标。但四种小鼠中仅BABL/c小鼠、C57BL/6小鼠的水平运动、垂直运动得分可从10 d持续维持降低趋势， 直至造模后20 d， 其中C57BL/6小鼠得分降低尤为显著， 说明C57BL/6小鼠对CUMS更为敏感， 且具有抑郁症状持续时间长的优点， 适于长期给药的药效学研究。糖水偏好实验及旷场实验中均表现出雌性动物较雄性动物更为敏感的特征， 这一结果与人类抑郁症流行病学特征相符［1］。

下丘脑- 垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA）功能亢进［12］是抑郁症发病机制中被多数学者接受的学说之一。GR在海马组织中表达水平相对较高，是海马组织对HPA轴进行负反馈调节的主要机制。已有研究表明，抑郁症患者及动物模型海马组织均存在GR蛋白低表达和HPA轴亢进的现象［13-15］。近年来国内外学者已通过代谢组学、基因组学、蛋白组学等手段对抑郁症的分子机制和遗传机制进行了初步研究，并通过大规模临床数据荟萃对抑郁症的可能病因进行了探索。已筛选到的与抑郁症相关的生物标志物以达数十种之多，其中氨基酸代谢途径中的主要生物标志物为色氨酸、KYN、5-HT等； 能量代谢途径中的主要生物标志物为葡萄糖、丙酮酸等； 酮体代谢途径中的主要生物标志物为3-羟基丁酸等［16］。动物模型及临床分析中均已发现抑郁症模型或患者脑组织存在KYN升高和5-HT降低现象。因此，本研究对小鼠慢性抑郁症模型的海马组织GR蛋白表达水平及5-HT、KYN等标志物的含量变化进行了定量研究，以初步探索不同品系小鼠对CUMS的易感机制。

研究结果表明， C57BL/6小鼠对照组GR显著低于其他三种小鼠、KYN显著高于其他三种小鼠， 且造模后GR、KYN降低或升高更为显著。而在上述行为学评价中， C57BL/6小鼠对CUMS更为敏感。因此， 推测小鼠海马组织GR、KYN水平差异可能是导致C57BL/6小鼠对CUMS更为敏感的原因。其中GR受体低表达会导致HPA轴亢奋，因此C57BL/6小鼠对CUMS更为敏感可能与HPA轴相关标志物的表达水平有关［12］。国外研究报道，小鼠给予KYN后更易表现出抑郁行为特征［17］， 与本研究结果一致。KYN、5-HT均为脑内色氨酸代谢的重要通路，在本研究中，各对照组小鼠海马组织内KYN含量存在显著差异，而5-HT含量未见显著差异，可能与5-HT在脑组织不同部位的分布差异差异有关［18］。

综上所述，KM、ICR、BABL/c、C57BL/6四个品系小鼠中，C57BL/6小鼠对CUMS刺激更为敏感，适于构建CUMS抑郁模型。其敏感机制可能与海马组织中GR、KYN含量有关。

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Screening of Mouse Strain Susceptive to Chronic Stress Depression and Preliminary Research on Its Mechanism

XU Long-jin， WANG Kou-zhou
（1.Shandong Center for Disease Control and Prevention， Ji’nan， 250014， China；2.Laboratory Animal Center of Shandong Province， Ji’nan， 250011， China）

Objective To screen mouse strain that susceptive to chronic unpredicted mild stress （CUMS） and preliminarily research its susceptive mechanism.Methods KM， ICR， BABL/c and C57BL/6 mice were used to establish CUMS depression model.Body weight， sucrose preference test（SPT）， open field test （OFT） were used to evaluate the sensitivity of mice to CUMS.Hippocampal levels of glucocorticoid reccptor （GR）， 5-hydroxytryptamine（5-HT）， kynurenine（KYN） were measured and used for susceptive mechanism research.Results Body weight， SPT， horizontal movement score and vertical movement score of C57BL/6 mice were found to susceptive to CUMS.SPT， horizontal movement score and vertical movement score of BABL/c showed similar tendency.Hippocampal levels of GR and KYN of normal C57BL/6 mice were significantly lower or higher than that of normal KM， ICR and BABL/c mice.Conclusions The C57BL/6 mouse is most susceptive to CUMS among 4 strains tested， and hippocampal levels of GR and KYN may be the main mechanism responsible for its susceptibility.

Mouse； Chronic stress； Susceptive strain； Mechanism

R749.4 Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0257-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.003

2016-05-30

国家自然科学基金（31171219）

徐龙进（1973-）， 男， 博士， 副主任技师， 主要研究方向： 实验动物管理。E-mail： sdxulongjin@163.com

王可洲（1974-）， 男， 基础兽医学博士。E-mail：wangkezhou_cn@163.com