近交系侏儒大鼠的培育及其主要生物学特性测定

姚菊芳， 华征宇， 王 斌， 孙志锴， 戴慧莉（上海交通大学附属仁济医院， 上海 200127）

近交系侏儒大鼠的培育及其主要生物学特性测定

姚菊芳， 华征宇， 王 斌， 孙志锴， 戴慧莉
（上海交通大学附属仁济医院， 上海 200127）

目的 建立侏儒大鼠近交系 。 方法 选择Wistar大鼠群中出现的疑似侏儒症突变动物，采用“全同胞兄妹交配”培育和维持，测定分析其各年龄段生长发育、繁殖性能、脏器重量、血液生理（12项）生化（12项）等主要指标，作为品系参考值，并与原种Wistar大鼠进行比较。 结果 至2016年2月， 侏儒大鼠实现连续近交达22～23代，品系暂时命名为“侏儒大鼠”（SDWR）。SDWR幼年、青年及成年体质量分别仅为相应年龄段Wistar的45.7%， 37.5%， 36.2%（♂）和49.7%， 41.7%，40.3%（♀）（P＜0.01）； SDWR青年期体长、尾长分别仅为Wistar大鼠的77.5%、72.3%（♂）和73.8%、68.9%（♀）（P＜0.01），即随年龄增长SDWR与原种Wistar体质量和体尺差异显著增加。SDWR青年及成年期主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、睾丸/输卵管）重量显著低于同年龄Wistar大鼠（P＜0.01）。SDWR主要繁殖性能（产仔数、窝重、离乳率）均显著低于原种Wistar大鼠（P＜0.01）。血液生理生化主要指标SDWR与Wistar差异不明显。 结论 通过长期近交培育成的SDWR在生长发育、体尺、繁殖性能、脏器重量等方面均明显体现侏儒症状，并能稳定遗传。

侏儒症； 近交系； 侏儒大鼠（SDWR）； 体质量； 体尺； 脏器重； 血液生理生化

人类侏儒症（Dwarfism）主要是由基因引起的疾病，会导致身材矮小和骨骼不成比例生长。尽管任何一对夫妻都有可能生下一个侏儒的孩子，但侏儒夫妻有80%的机会生下与他们一样症状的后代。除了侏儒症状，一些患者还伴有心脏和呼吸系统疾病，这会显著缩短他们的寿命；还有一些患者有异常或太小的内脏器官，会使长期生存变得困难。

侏儒症的常见病因包括： ①骨胳系统疾病如软骨营养不良和抗维生素D性佝偻病； ②先天性酶的代谢缺陷如粘多糖病和肝糖原累积症； ③内分泌障碍如垂体性侏儒症，甲状腺功能减退（克汀病）； ④家族性矮小症和原发性侏儒症； ⑤长期大剂量肾上腺皮质激素的应用等等。绝大多数的病因都与基因缺陷有关。近交系侏儒症动物模型的建立将为侏儒症病因、诊断、干预、预后、预防和优生优育等的研究提供有力的实验手段。

多种方法可以制作出垂体性侏儒动物模型［1，2］，并用于模拟“垂体性侏儒症”，进行相关的病因、诊断、干预的研究。然而，自发性侏儒动物模型更有利于从基因突变方式、分布及基因定位的角度对侏儒症及其相关疾病进行系统研究。陈芷沅教授于1982年在津白3（TA3） 小鼠群体中发现侏儒小鼠［3］，经十多年的繁殖与选种培育成近交系。这种侏儒小鼠是由一个基因缺陷决定的垂体性缺陷模型。研究表明，侏儒鼠与多个系统的功能改变和疾病有关［4-9］，包括内分泌系统、代谢系统、消化系统、心血管系统、神经系统、运动系统、免疫系统和应激系统等。更为突出的是与长寿、睡眠、智力和抗肿瘤密切相关［10-14］，从而进一步拓展了侏儒鼠的研究应用范围。目前国内外自发性侏儒鼠模型大多集中在小鼠，尤其是国内尚无自主繁育的自发性侏儒大鼠的相关报道。

2007年作者在 Wistar大鼠繁育群中意外发现一窝体型与同龄、同性别个体相比显著矮小的大鼠，自离乳至成年，体质量和体尺的差异越加明显，疑似突变引起的自发侏儒症。经22～23代全同胞亲兄妹近交（B×S）培育， 目前已形成一定的规模和种群数量，种群的生物学特征逐渐稳定，具有符合自发性侏儒症动物品系评价标准的趋势，又呈现出独有的不同于自发性侏儒小鼠的生物学和遗传学特点。对这种大鼠种群和品系的深入研究与培育， 可能为人类遗传性侏儒症研究提供良好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其设施

清洁级突变-近交系侏儒大鼠及其对照封闭群Wistar大鼠。饲育环境为本院屏障设施+IVC［SYXK（沪）2011-0121］。

1.2 主要仪器

TP2101电子天平（中国上海兴澄衡器有限公司）； IVC-Ⅱ（中国江苏省苏州市冯氏实验动物设备邮箱公司）； 游标卡尺（中国上海量具刃具厂）； HITACHI 7600 series Automatic Analyzer （日本株式会社日立制作所）； HEMAVET 950（美国Drew公司）； Thermo Fisher（美国Thermo公司）

1.3 培育方法和命名

采用“全同胞兄妹（B×S）交配”方法培育和维持突变-近交系侏儒大鼠品系。当出现不孕或性别比例严重失衡时以“亲子交配方式”作为B×S交配的补充。以“修饰平行线法”建立各世代谱系。一般以第2、3胎动物作为近交传代亲本。按照近交系培育管理规范，对核心群每只大鼠均实行谱系登记。主要内容有： 自身编号（世代数，胎次、序号等信息）； 双亲编号； 出生、初配、生产、离乳、淘汰日期等等。按照国际标准命名法则实施品系命名。

1.4 主要测定内容

自出生（初生）至16周龄（成年）， 对侏儒大鼠进行各周龄体质量测定， 以侏儒大鼠4周龄（幼年）至16月龄（成年）体质量与原种Wistar大鼠相应年龄、性别体质量作差异显著性检验。统计侏儒大鼠主要繁殖性能指标（初生窝重、胎产仔数、胎间隔、离乳率）， 观察其遗传稳定性， 并与原种Wistar大鼠作差异显著性检验。测定幼年期（4周龄）侏儒大鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、睾丸/输卵管）重量， 作为品系参考值； 测定成年期（16周龄）侏儒大鼠和Wistar大鼠主要脏器重量， 进行差异显著性检验。测定幼年期（4周龄）侏儒大鼠血清总蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）等12项生化指标，作为品系参考值； 比较测定、分析青年期（8周龄）和成年期（16周龄）侏儒大鼠和Wistar大鼠主要生化指标。测定幼年期（4周龄）侏儒大鼠血液白细胞总数（WBC）、红细胞总数（RBC）； 血红蛋白（HB）等12项血液学指标， 作为品系参考值； 比较青年期（10周龄）侏儒大鼠和Wistar大鼠主要血液学指标。

1.5 统计学处理

各测定组值以x- ± s表示。侏儒大鼠与Wistar大鼠组间比较采用独立t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 突变近交系建立

2.1.1 建立近交系 自体成熟起，对疑似自发性侏儒大鼠采取全同胞兄妹交配（B×S）方法建立近交系核心群， 用“修饰平行线法”保种传代，以第2、第3胎同代同兄妹作为传代亲本。目前近交保持已经达到22～23代，第23代近交系数F23=99.21%。

2.1.2 品系命名 根据侏儒症特点，参照国际命名法则，将疑似侏儒症突变-近交系大鼠暂时命名为“侏儒大鼠”（SDWR）。

2.1.3 正反交试验 在近交过程中，尝试以SDWR ♂×Wistar♀及SDWR♀×Wistar♂正、反交方式，观察后代体质量和体尺， 均未表现出明显侏儒症状。表明SDWR可能是由多基因隐性遗传造成。

2.2 SDWR大鼠主要繁殖性能

SDWR大鼠与原种Wistar大鼠主要繁殖性能比较见表1。SDWR大鼠产仔数、窝重、离乳率均显著低于Wistar （P＜0.01），胎间隔无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 SDWR体质量

从表2可见， SDWR大鼠从幼年期（4～5周龄）至成年期（16周），其各周龄体质量均显著小于同年龄、同性别Wistar大鼠（P＜0.01）。幼年（4周龄）、青年（10周龄）和成年（16周龄） SDWR体质量仅为Wistar大鼠相应年龄段的45.7%， 37.5%， 36.2%（♂）和49.7%，41.7%，40.3%（♀），即各年龄阶段SDWR体质量均不到Wistar的一半，且随着年龄增长，这种体质量弱小的差异程度更加明显，是侏儒症的典型表现。从建立近交系至今，SDWR生长缓慢、体质量低的特性保持不变，并能稳定遗传。

表1 SDWR与Wistar大鼠主要繁殖性能比较

2.4 SDWR大鼠主要体尺指标

SDWR大鼠体长、尾长增长缓慢， 1岁以后基本停止增长或逐渐缩减（表3）。10周龄SDWR大鼠体长、尾长（表3）与Wistar大鼠体长（36.4±1.8 cm♂，34.3±1.4 cm♀）、尾长（15.4±1.2 cm♂， 14.8± 0.9 cm♀）比较，分别仅为Wistar大鼠的77.5%、 72.3%（♂）和73.8%、68.9%（♀）， 均有极显著差异（P＜0.01）， 明显体现侏儒症状。10周龄SDWR及Wistar大鼠体型比较见图1、图2。

2.5 SDWR大鼠主要脏器重量

4 周龄SDWR大鼠脏器重量测定结果见表4。成年期（16周龄）脏器绝对重量SDWR均显著低于Wistar大鼠（P＜0.01，表5），也是矮小、侏儒特征的重要体现。

2.6 SDWR主要血液生化指标

4 周龄SDWR大鼠12项生化指标： 白蛋白（ALB）；碱性磷酸酶（ALP）； 丙氨酸转氨酶（ALT）； 天冬氨酸转氨酶（AST）； 尿素氮（BUN）； 肌酐（CREA）； 葡萄糖（GLU）；高密度脂蛋白（HDL）； 低密度脂蛋白（LDL）； 总胆固醇（TCH）； 甘油三酯（TG）； 总蛋白（TP）测定结果见表6。

表2 SDWR和Wistar大鼠体质量比较 g

表3 不同年龄段SDWR大鼠体长、尾长测定结果 cm

图1 10周龄SDWR与Wistar体型比较（♂）

图2 10周龄SDWR与Wistar体型比较（♀）

16周龄SDWR大鼠两性别部分生化测定值（AST、BUN、CREA、TG、TP等）与Wistar有显著差异（表7）。

2.7 主要血液生理指标

4 周龄SDWR大鼠12项血液学指标：白细胞总数（WBC）、红细胞总数（RBC）、血红蛋白（HB）、红细胞比容（HCT）、平均血红蛋白含量（MCH）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）、中性粒细胞比率（NE%）、淋巴细胞比率（LY%）、嗜酸性粒细胞比率（EO%）、单核细胞比率（MO%）、嗜碱性粒细胞比率（BA%）测定结果见表8。

表4 4周龄SDWR大鼠主要脏器重量 g

表5 16周龄SDWR与Wistar大鼠主要脏器重量比较 g

表6 4周龄SDWR大鼠生化指标

16周龄SDWR大鼠两性别血液测定值中白细胞总数（WBC）、血小板计数（PLT）和单核细胞比率（MO%）均显著低于Wistar（表9）。

3 讨论

至2016年2月，侏儒大鼠实现连续近交达22～23代。品系暂时命名为SDWR。SDWR幼年、青年及成年体质量分别仅为Wistar的45.7%， 37.5%，36.2%（♂）和49.7%，41.7%，40.3%（♀）（P＜0.01）；SDWR青年期体长、尾长分别仅为Wistar的77.5%、72.3%（♂）和73.8%、68.9%（♀）（P＜0.01）； SDWR青年及成年期主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、睾丸/输卵管）重量显著低于同年龄Wistar大鼠（P＜0.01）。除部分指标外，SDWR大鼠主要生化、血液学测定值与Wistar相比差异不大。

表7 16周龄SDWR与Wistar大鼠生化指标

表8 4周龄SDWR大鼠血液学指标测定

表9 16周龄SDWR与Wistar大鼠血液学指标测定

人类侏儒症主要表现是生长缓慢，具体体现在体质量、体尺比同年龄、同性别个体显著低下。作者通过对原种Wistar繁殖群中出现的疑似侏儒症状突变动物，通过长期近交培育，表明其在在生长发育、体尺、繁殖性能、脏器重等方面体现明显的侏儒特征，并能稳定遗传，其遗传机制有待进一步研究。

（鸣谢：本课题实施和完成阶段，得到上海斯莱克实验动物有限公司徐平研究员的指导和支持，谨致谢意。）

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Breeding of Inbred Dwarf Rats and its Main Biological Characteristics

YAO Ju-fang， HUA Zheng-yu， WANG Bin， SUN Zhi-kai， DAI Hui-li
（Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200127， China）

Objective To breed the inbred strain of dwarf rat and determine the main biological characteristics.Methods The spontaneous mutant litters looks like dwarfism from the Wistar conlony was bred and maintained by brother×sister （B×S） mating system for 22-23 progenies and nominatured as spontaneous dwarfism rat （SDWR） according the standard.As reference of strain， indexes of growth and development， body measurements， reproductive performance， organ weight， serum biochemical （12 items） and hematology （12 items） about dwarf rat at different age stages were measured， and be compared with background Wistar rat.Results Up to February 2016， the dwarf rat was inbreded continuously for 22-23 generations， and named as SDWR temporarily.The weight of weanling， youth and adult individuals in SDWR was respectively only about 45.7%， 37.5%， 36.2%（♂） and 49.7%，41.7%， 40.3%（♀） of the same age Wistar rats （P＜0.01）.The body and tail length of youth and adult individuals in SDWR is respectively 77.5%， 72.3% （♂） and 73.8%， 68.9%（♀） of Wistar rats （P＜0.01）.The weights of major organs （heart， liver， spleen， lung， kidney， testis or oviduct tubes） in youth and adult SDWR are significantly lower than that of the same ages Wistar rats （P＜0.01）.Conclusions Through 22-23 progenies inbreeding， the established inbreeding strain of SDWR exhibited obvious dwarfism symptoms in growth， body measurements， reproductive performance and organs weight， and has stable heredity.The rat may be useful as animal models for the study of inherited dwarfism in human.

Dwarfism； Inbred strain； Spontaneous dwarfism rat （SDWR）； Body mass； Body size； Organ weight； Physiological and biochemical indexes of blood

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0295-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.010

·经验交流·

2016-03-25

上海市科委课题［13140900100］

姚菊芳（1964-）， 女， 主管技师，E-mail： yaoshirley@163.com