超高效液相色谱-串联质谱测定鸡饲料中黄曲霉毒素B1

2016-09-15叶日金冯志强庄俊钰广东省食品质量监督检验站冯志强庄俊钰广东省食品工业研究所叶日金广东省食品工业公共实验室

食品安全导刊 2016年21期

□ 叶日金　冯志强　庄俊钰　陈　茹　广东省食品质量监督检验站　冯志强　庄俊钰　林　丹　广东省食品工业研究所叶日金　林丹　陈茹　广东省食品工业公共实验室

□ 叶日金冯志强庄俊钰陈茹广东省食品质量监督检验站冯志强庄俊钰林丹广东省食品工业研究所
叶日金林丹陈茹广东省食品工业公共实验室

建立一种用超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡饲料中黄曲霉毒素B1的检测方法，并对广州市售11种鸡饲料进行了分析。试样经70%甲醇-水溶液超声提取，黄曲霉毒素B1免疫亲和柱净化；以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm ×1.7 μm）色谱柱分离，电喷雾正离子模式进行质谱测定。结果表明：该方法的黄曲霉毒素B1检出限为0.5 ng/ mL，线性范围为0.5000～50.00 ng/ mL，相关系数为0.993 7，以空白样品为基质3个加标水平下黄曲霉毒素B1的平均回收率为88.8%～93.5%，RSD＜5.0%。该方法准确高效，重现性好，可实现鸡饲料中黄曲霉毒素B1的测定。

高效液相色谱-串联质谱；黄曲霉毒素B1；鸡饲料

真菌毒素是霉菌等真菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物[1]。目前已知的真菌毒素有300多种，黄曲霉毒素为最常污染饲料的真菌毒素之一，其中以AFTB1的毒性最强[2-5]。

文献显示黄曲霉毒素B1在蛋禽配合饲料中检出率最高，雏禽配合饲料和蛋禽配合饲料中超标最严重，超标率分别为11.0%和14.0%[6]。黄曲霉毒素感染能使雏鸡机体免疫机能下降，生长受阻，抗体水平降低，严重时导致死亡[7]。

黄曲霉毒素检测主要以薄层色谱和酶联免疫法快速检测为主，高效液相法及高效液相色谱-串联质谱法为辅[8，9]。薄层色谱和酶联免疫法方法简单、快速，对人员的要求不高，但准确性不高，容易出现假阳性等，不能作为最终确证的方法。液相色谱法往往需要柱前衍生或配备专用衍生器，成本高，耗时长不适用于大批量的检测。高效液相色谱-串联质谱快速、高效、集定性定量于一体，是近年来黄曲霉毒素研究的主要方向[10]，并且已经应用到检测当中。目前国内尚未见有采用高效液相色谱-串联质谱（三重四级杆）针对鸡饲料中黄曲霉毒素B1检测的研究。

本研究运用超高效液相-三重四级杆串联质谱测定鸡饲料中黄曲霉毒素B1。样品经70%甲醇水溶液提取、免疫亲和柱净化，正离子模式下使用乙腈-0.1%甲酸水为流动相梯度洗脱，采用Waters Acquity UPLC®BEH C18色谱柱分离，外标法定量。该方法准确高效，重现性好，可实现鸡饲料中黄曲霉毒素B1的测定。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品

收集广州市售11种鸡饲料（分别为肉小鸡料、肉大鸡料、肉中鸡料、快大型黄鸡小鸡料、快大型黄鸡中鸡料、快大型黄鸡大鸡料、快大型鸡小鸡料、快大型鸡大鸡料、育肥鸡料和种鸡料）共24批次。

1.1.2主要仪器与试剂

Waters H-class Xevo TQD液相色谱串联质谱(ESI源)；色谱柱：Waters Acquity UPLC®BEH C18柱(2.1 mm×50 mm ×1.7 μm)。万分之一天平AG204，KQ-500DE型超声波清洗，日立CF15RXⅡ离心机。

AFTB1标准溶液，25.00 μg/mL，广州泛宏贸易有限公司；乙腈、甲醇，色谱纯，飞世尔（Fisher）公司；甲酸，色谱纯，上海安谱科学仪器公司；黄曲霉毒素免疫亲和柱，3 mL，BIOSTEST公司；50 mMPBS溶液。

1.2方法

1.2.1样品制备

称取样品20 g于50 mL比色管中，加入100 mL 70%甲醇水，涡旋混合、超声20 min，10 000 r/min，离心5 min，收集上清液。

1.2.2样品纯化

取5 mL样品提取液，加入20 mL PBS（pH=7.4）溶液，涡旋混匀1 min，将试液以1 mL/min的流速全部通过免疫亲和柱，加入50 mM PBS/甲醇，90/10 V/V以3 mL/min的流速淋洗免疫亲和柱去掉杂质。准确加入1 mL甲醇，等待30 s，收集样品洗脱液，用微孔过滤膜（0.22 μm）过滤后供进样。

1.2.3空白基质溶液的配置

分别称取与待测样品基质相同且不含待测成分的样品，按1.2.1及1.2.2制备方法操作，制备空白基质溶液。

1.2.4仪器条件

液相条件：色谱柱：Waters Acquity UPLC®RBEH C18柱(2.1 mm×50 mm× 1.7 μm)；进样量5 μL；柱温40 ℃；流速0.40 mL/min；流动相：0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序见表1。

质谱条件：电喷雾源ESI+，脱溶剂气温度550 ℃，脱溶剂气流速1000 L/min，锥孔气50 L/min，毛细管电压2.50 kV。黄曲霉毒素B1MRM 检测的相关质谱参数见表2。

2　结果与分析

2.1色谱条件的优化

本实验考察了液相色谱-质谱联用分析中常用的两大流动相体系（甲醇-水和乙腈-水）对黄曲霉毒素色谱的影响。同时由于黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，在结构上更容易得到质子，因此，实验选择正离子模式。实验表明：在正离子模式下（流动相中含0.1%甲酸），甲醇在色谱分离系统效果较乙腈要好，但其离子化程度受到较大的抑制，乙腈作为流动相时的离子化程度高，响应值、灵敏度等均比甲醇要好。因此本实验采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相，梯度洗脱。

2.2样品前处理的优化

本实验分别研究了甲醇-水系列（体积分数分别为35%、60%、70%、84%和90%）和乙腈系列（体积分数分别为35%、、60%、70%、84%和90%）作为提取剂进行了比较，结果发现甲醇体积分数增加至70%时黄曲霉毒素B1提取率不再增加，乙腈体积分数84%提取效率最好，但考虑到有机相比例太高会影响免疫亲和柱的活性，且甲醇的毒性相对乙腈较低，价格亦相对便宜，因此选择70%的甲醇水溶液为提取剂。

2.3标准曲线及相关系数

移取适量AFTB1标准品，用流动相稀释定容，得到浓度为100.0 ng/ mL标准溶液使用液。并移取上述标准品溶液适量，用空白基质溶液配制成浓度分别为0.500 0、1.000、5.000、10.00、20.00 ng/mL和50.00 ng/mL的标准曲线供LC-MS /MS检测。以标准工作液峰面积y为纵坐标，浓度x(ng/ mL)为横坐，标绘制标准曲线。方法检出限(LOD)依3倍基线噪音S/N=3所得。检测结果见表3。