应用正交设计筛选小叶章诱导培养基的配方

张玉，冷海楠，徐明怡，倪红伟，王丽媛（黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040）

应用正交设计筛选小叶章诱导培养基的配方

张玉，冷海楠，徐明怡，倪红伟*，王丽媛
（黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040）

以小叶章的茎段作外植体，采用正交设计法，考察6-BA、TDZ、NAA三种激素对小叶章初代培养产生的影响，确定适宜的激素种类及水平，优化筛选出适宜小叶章的诱导培养基.研究表明，激素6-BA是茎段诱导的关键因素；适宜小叶章初代培养的培养基配方为：1/2MS+6-BA0.5 mg·L-1+ TDZ0.1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

小叶章；正交设计；诱导培养基

小叶章（CalamagrostisangustifoliaKom.）又名苫房草，是禾本科拂子茅属多年生根茎型草本植物，在我国主要分布于东北、华北、内蒙古等地区的平原低洼湿地，是三江平原典型草甸、沼泽化草甸的建群植物和优势植物［1-4］。近年来，小叶章的种群受到严重的破坏，生态功能下降。而无性繁殖是种群扩繁的常用方法。尤其通过组织培养方法不仅可以克服种子繁殖中存在的问题，而且可以克服扦插繁殖速度慢、繁殖率低的缺点［5］。因此利用组织培养技术，建立完整的小叶章组培快繁体系，显得尤为重要。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验于2015年6月至2015年12月在黑龙江省科学院自然与生态研究所分子生物学实验室进行。选取当年新生无病虫害、生长健壮的幼嫩茎段作为外植体。

1.2试验方法

1.2.1培养基条件

以MS为基本培养基，添加蔗糖30g·L-1和琼脂6 g·L-1，调整pH值为5.5-5.8，配制分装后于121℃灭菌20 min。培养温度为（25±2）℃，光照强度40μmol·m-2·s-1每天光照16 h·d-1。

1.2.2外植体预处理

将采集的茎段，去除叶片和叶柄，流水冲洗30min，剪成4-6 cm长的茎段（每段带1个节），再用适量的洗洁精水冲洗2遍，自来水冲洗干净后置于超净工作台中。

1.2.3外植体消毒试验

在超净工作台上，用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗2次；用0.1％Hgcl2溶液消毒2、4、6、8、10、15min，期间不断摇晃，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分，于消毒过的滤纸上切除上下切口处的褐化部分，将材料切成1.5-2.0 cm、带1-2个叶腋的茎段并吸干茎段上的水分，接种于诱导培养基上。比较0.1％Hgcl2不同消毒时间的灭菌效果，7d后观察污染情况，14 d后统计污染率、成活率。污染率（％）=（污染数/接种数）×100％；成活率（％）=芽诱导直接成苗率/接种未污染芽数×100％。

1.2.4诱导试验

将消毒好的小叶章茎段接种在初代诱导培养基MS，同时添加不同种类和浓度的激素。按照表1设计正交实验的因素和水平，采用L9（34）正交表设计初代诱导培养基（表2）。每瓶一个茎段，每个处理接种30瓶，重复3次。30天后统计腋芽萌芽率。筛选小叶章茎段不定芽诱导启动的最佳激素浓度配比。

1.3数据分析

实验结果采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.5分析软件对试验数据进行处理与统计分析。

2　结果与分析

2.1不同处理对小叶章外植体消毒效果的影响

由表3可以看出，不同的消毒时间对小叶章外植体的接种是有一定的影响的。

随着0.1％HgCl2消毒时间的增加，外植体污染率下降，而成活率先升高后降低，4min时达到最高，71.6％，当消毒15min时，外植体全部死亡，所以75％酒精30s+0.1％HgCl24 min消毒效果最好。

表1　正交试验的因素和水平

表2　按正交表设计的培养基配方

表3　不同消毒时间对小叶章茎段灭菌效果的影响

表4　不同植物生长调节剂对小叶章茎段初代培养的影响

2.2不同激素对小叶章腋芽诱导的影响

极差分析表4显示：根据R值确定6-BA、TDZ、NAA对小叶章不定芽诱导的影响大小为：6-BA＞ NAA＞TDZ，从各因素水平均值（k）的大小可以看出最优水平组合为：6-BA（0.5 mg·L-1）TDZ（0.1 mg·L-1）NAA（0.1 mg·L-1）；方差分析表5显示：6-BA对试验结果的影响达极显著水平（P＜0.01），TDZ、NAA对试验结果达到显著差异（P＜0.05），根据F值可以看出，3个因素对试验结果的影响大小为6-BA＞NAA＞TDZ，同极差分析结果一致。

综合极差分析与方差分析结果，得出小叶章芽诱导启动的最优水平组合为6-BA（0.5 mg·L-1）TDZ（0.1 mg·L-1）NAA（0.1 mg·L-1），即：1/2MS+6-BA0.5 mg· L-1+TDZ0.1 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

3　讨论

在植物的组织培养中，确定初代培养的配方往往是首要的工作。在试验初期阶段若依靠进行多次实验进行筛选，则不仅费时费力且结果常常并非最佳组合，因而使试验带有一定的盲目性。采用正交设计可以用较少的试验次数获取较多的信息，是一种高效率、快速、经济的方法［6］。

表5　正交设计方差分析表（完全随机模型）

图1　芽诱导正交设计试验结果极差图

本试验中以1/2MS培养基为基本培养基，选用了6-BA、TDZ、NAA3种生长调节物质，各设3个浓度，进行3因素3水平正交试验，并对试验数据做了直观分析和方差分析，以确定6-BA、TDZ、NAA对芽诱导的作用，进而对芽诱导效应做出准确的评价。本试验中6-BA0.5 mg·L-1是一个较适宜的浓度，芽诱导虽然有相对较好的表现，但各种组合结果均处于一个低的水平。我们猜测：影响小叶章芽诱导的显著因素可能是其他植物激素种类，也可能是培养条件与激素的互作的影响。由图1可知：细胞分裂素6-BA浓度小于0.5mg/L可能效果会更好，这方面需要进一步的试验工作来验证。

［1］倪红伟.三江平原典型草甸小叶章种群地上器官生物量及其分层结构［J］.植物研究，1996，16（03）：356-362.

［2］倪红伟，臧淑英，高亦珂.三江平原沼泽化草甸小叶章种群地上生物量及其生长速率季节动态的研究［J］.植物研究，1996，16（04）：122-128.

［3］倪红伟，张兴，贾利.三江平原典型草甸小叶章种群地上生物量动态［J］.植物研究，1998，18（03）：72-79.

［4］王建波，倪红伟，付小玲.大气CO2浓度升高对小叶章光合色素含量和光合参数的影响［J］.国土与自然资源研究，2013 （01）：82-83.

［5］吴安湘，金晓玲，熊芳.珍稀濒危植物组织培养研究进展.西北植物学报，2006，26（1）：211-216.

［6］杜荣骞.生物统计学［M］.北京：高等教育出版社，1989.

（2016-01-18收稿刘晓佳编辑）

Selection of Induction Medium for Calamagrostisangustifolia by Orthogonal Design

ZHANG Yu et al
（Institute of Natural Resources and Ecology，HAS.National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation，Harbin 150040，China）

Young stem from Calamagrostisangustifolia was used as explants.The effects of three kinds of hormones including 6-BA，TDZ，and NAA on Calamagrostisangustifolia were studied.The proper induction medium isselected out by orthogonal design，moreover，the kind and suitable level of hormone were ascertained.The results show that 6-BA is the critical factor for induction，the optimummedium forinitiation is:1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+TDZ0.1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1.

Calamagrostisangustifolia；Orthogonal design；Induction medium

S188

A

1003-7853（2016）02-0087-03

黑龙江省科学院创新基金资助项目

张玉（1983-），女，黑龙江东宁县人，硕士，助理研究员，主要从事分子生态方向研究。

倪红伟（1964-）。