联合抗体免疫组织化学检测胸水细胞对恶性间皮瘤诊断的应用价值分析

丁春晓张 洋张 恒王 健乔菊久李建华*

（（1辽宁省中医药研究院病理科，沈阳 110034；2沈阳市第四人民医院病理科，沈阳 110031；3中国医科大学基础医学院病理教研室，沈阳 110013）



联合抗体免疫组织化学检测胸水细胞对恶性间皮瘤诊断的应用价值分析

丁春晓1张 洋2张 恒3王 健3乔菊久1李建华3*

（（1辽宁省中医药研究院病理科，沈阳 110034；2沈阳市第四人民医院病理科，沈阳 110031；3中国医科大学基础医学院病理教研室，沈阳 110013）

目的 探讨在胸水沉渣包埋切片中，应用免疫组织化学技术诊断恶性间皮瘤时，联合抗体套餐的最佳选择。方法对523例胸水标本进行液基学检测，并对其中诊断结果为恶性间皮瘤的63例及肺腺癌的52例胸水标本进行离心沉渣后包埋、切片，采用免疫组织化学方法检测细胞角蛋白5/6（CK5/6）、细胞角蛋白7（CK7）、甲状腺转录因子-1（TTF-1）、波形蛋白（Vim）、P53、间皮细胞（MC）抗体、钙视网膜蛋白（CR）、表皮生长因子受体（EGFR）、E-钙粘蛋白（E-cad）、癌胚抗原（CEA）的表达，比较这些抗体的阳性表达率，特异性及敏感性，探讨诊断恶性间皮瘤联合抗体的最佳套餐选择，同时对临床较常见的粘液型及乳头状型恶性间皮瘤组化结果进行比较，分析恶性间皮瘤的形态学分型对免疫组化结果有否影响。结果 在63例恶性间皮瘤患者中，CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim的阳性表达率较高，在52例肺腺癌患者中，TTF-1和CEA的阳性率表达率最高；CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim TTF-1、CEA特异性和（或）敏感性较高。结论 诊断恶性间皮瘤的最佳联合抗体套餐选择为CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1、CEA；粘液型及乳头状型恶性间皮瘤抗体阳性表达率无明显区别。

胸水；沉渣包埋；恶性间皮瘤；液基细胞学

恶性间皮瘤是一种少见的中胚层来源的恶性肿瘤，具有高度侵袭性，好发于胸膜，发生于胸膜者约占恶性间皮瘤的80%［1］，约占肿瘤的5%，近年来其发病率有逐年增加的趋势，在美国和加拿大的发病率为2/100万人～20/100万人。美国最常见的引起弥漫性恶性间皮瘤的原因是暴露于石棉之下并且吸入石棉，通常来讲，从暴露在石棉之下直至发生恶性间皮瘤需要几十年时间的潜伏期。由于临床症状不典型，给恶性间皮瘤的临床和病理诊断带来诸多困难。近年来，由于对间皮瘤的认识水平的提高和电镜、免疫组织化学技术的应用使胸膜恶性间皮瘤的诊断水平有了很大提高。然而在诸多抗体中，如何选择特异性及敏感性高的抗体，从而对恶性间皮瘤做出早期、准确的诊断，显得尤为重要，本实验选择的10项抗体中，既往研究表明，细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）主要表达于上皮组织，临床上主要用于鳞癌及腺癌的鉴别［2］，间皮细胞（mesothelial cell，MC）抗体、钙视网膜蛋白（Calretinin，CR）均主要表达于间皮细胞及其发生的肿瘤［3］，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、E -钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）则表达于多种上皮，其过度表达，主要与肿瘤的发展、侵袭和转移等密切相关［4、5］，波形蛋白（Vimentin，Vim）表达于大多数的间叶源性细胞及其发生的肿瘤，P53作为抑癌基因，则被作为判断预后及复发［6］，而甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor 1，TTF-1）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作为常用的肺腺癌及胃肠道恶性肿瘤等疾病的诊断抗体［7、8］，选择其作为恶性间皮瘤诊断的阴性对照抗体。依据以上，本实验通过对63例恶性胸膜间皮瘤患者和52例肺腺癌患者的胸水沉渣包埋切片进行免疫组化染色，对比阳性结果，探讨恶性间皮瘤诊断的最佳抗体套餐的选择，以达到减少患者的经济负担及以最少、最准的抗体选择确诊恶性间皮瘤的目的。

材料和方法

1 病例

收集中国医科大学附属第一医院病理科2014年1月—2016年1月胸水标本523例，其中女性187例，年龄53～79岁，中位年龄62岁；男性336例，年龄52～89岁，中位年龄73岁。对胸水诊断结果为可疑阳性及异性增生细胞进行离心沉渣包埋，HE及免疫组织化学染色，通过病理诊断得到63例恶性间皮瘤胸水沉渣标本，其中男性52例，中位年龄70岁；女性11例，中位年龄67岁；肺腺癌52例，男性32例，女性20例。

2 试剂

鼠抗人CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、CK7、P53、E-cad、TTF-1、CEA抗体均购自福州迈新生物技术有限公司销售的美国Biox公司产品。免疫组织化学S-P试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

3 液基细胞薄层检测技术（Thinprep Cytologic Test，TCT）

收集新鲜胸水20ml左右，室温下800r/min离心5min，弃去上清，取沉淀底层细胞，加入清洗液后再次离心，取沉淀与保存液混合后机器自动制片，手动中性树胶封片。

4 胸水沉渣包埋

采用液基细胞薄层方法（TCT）常规制片、诊断后，每份对应标本收集新鲜胸水200ml左右，经95%乙醇固定24h后石蜡包埋、切片。

5 免疫组织化学

采用链霉菌抗生物素-过氧化物酶（streptavidinperoxidase，S-P）法CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、CK7、P53、E-cad、TTF-1、CEA进行免疫细胞化学染色（一抗稀释度均为1：100），PBS缓冲液代替第一抗体作为空白对照，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片。

6 结果判定［9］

CK5/6、CEA、Vim细胞质着色为阳性，MC、E-cad细胞膜着色为阳性，CR细胞质或细胞核着色为阳性，TTF-1细胞核着色为阳性，阳性程度判断：细胞无着色或着色细胞数占总细胞数＜10%为（-）；阳性着色细胞数占总细胞数10%～25%为（+），26%～50%为（++），≥51%为（+++）；阳性表达即+～+++。每张切片选取5个高倍视野（400×），对免疫组织化学结果进行判读。

7 敏感度与特异度计算［10］

以免疫组织化学结果病理诊断为金标准，将间皮细胞相关抗原（Vim、MC CR等）在肺腺癌中的阴性表达定义为真阴性，阳性表达定义为假阳性；在恶性胸膜间皮瘤中的阳性表达定义为真阳性，阴性表达定义为假阴性。将上皮细胞相关抗体（TTF-1 CEA）在恶性间皮瘤中的阴性表达定义为真阴性，阳性表达定义为假阳性；在肺腺癌中的阳性表达定义为真阳性，阴性表达定义为假阴性。依据敏感性=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%进行计算。

8 统计分析

采用SPSS17.0统计软件对试验结果进行分析，率的比较采用χ2检验，P＜0.05表示结果具有统计学意义。

结 果

1 10种抗原在粘液型及乳头状型恶性间皮瘤中的表达

63例恶性间皮瘤患者中，依据病理镜下细胞排列形态等特点，区分出粘液型26例，乳头状型37例，经10种抗体免疫组织化学染色证实（图1），各抗体的阳性表达率在两型之间无统计学差异（表1）。

图1　粘液型及乳头状型恶性间皮瘤细胞病理学与免疫组织化学特征。A，恶性间皮瘤胸水TCT（巴氏染色）；B，乳头型恶性间皮瘤胸水沉渣包埋（HE染色）；C，粘液型恶性间皮瘤胸水沉渣包埋（HE染色）；D，CK5/6在乳头型恶性间皮瘤中的阳性表达（S-P法）；E，MC在粘液型恶性间皮瘤中的阳性表达（S-P法）；F，CR在粘液型恶性间皮瘤中的阳性表达（SP法）；G，EGFR在乳头型恶性间皮瘤中的阳性表达（SP法）；H，Vim在乳头型恶性间皮瘤中的阳性表达（SP法）；I，E-cad在乳头型恶性间皮瘤中的阳性表达（SP法）；比例尺，100μmFig.1 Cellular pathological and immunohistochemical features of papillary and mucous malignant mesothelioma.A，malignant mesothelioma pleural effusion TCT（Pap stain）；B，pleural effusion sediment embedding of the papillary type of malignant mesothelioma（HE stain）；C，pleural effusion sediment embedding of the mucous type of malignant mesothelioma（HE stain）；D，positive expression of CK5/6 in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；E，positive expression of MC in mucous malignant mesothelioma（S-P method）；F，positive expression of CR in mucous malignant mesothelioma（S-P method）；G，positive expression of EGFR in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；H，positive expression of Vim in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；I，positive expression of E-cad in papillary malignant mesothelioma（S-P method）；scale bar，100μm

表1　10种抗原在粘液型和乳头状型恶性间皮瘤中表达比较Table 1 Comparison of expressions of 10 kinds of antigens in mucinous and papillary malignant mesothelioma

2 10种抗体在恶性间皮瘤诊断中的应用价值分析

在胸水细胞标本中，最常见病变为转移性肺腺癌，因此，本实验应用免疫组织化学检测在恶性间皮瘤及转移性肺腺癌临床诊断中常用的10种抗体，用以对比抗体的阳性表达率、特异性及敏感性。由表2可以看出，横向对比，在二者之间，该10种抗原阳性表达率有统计学差异的是CK5/6、MC、CR、EGFR、 Vim、TTF-1及CEA；纵向对比，10种抗原在恶性间皮瘤之间的阳性表达率比较，最高的是CK5/6、MC、CR、EGFR及Vim，均大于85%，而特异性和（或）敏感性较高的，亦是CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1及CEA，均大于85%。综合以上各结果可知，诊断恶性间皮瘤的最佳抗体套餐选择是CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1及CEA。

表　2 10种抗原在恶性间皮瘤和肺腺癌中表达比较Table 2 Comparison of expression of 10 kinds of antigens in malignant mesothelioma and lung adenocarcinoma

讨 论

恶性胸膜间皮瘤作为临床上最常见的恶性间皮瘤，分型主要分为局限型和弥漫型［11］，而病理组织学则根据镜下细胞形态及组织结构分为乳头状型、粘液性型、未分化型、印戒样细胞型、小细胞型等多种形态分型。本实验收集了临床常见的两个形态学分型，即乳头状型及粘液型，对比两型各抗体的阳性率，发现并无明显区别，说明形态学分型对恶性间皮瘤临床诊断特异性上并无差异，既不存在某型恶性间皮瘤临床上易于早期或较易做出诊断的说法。由于恶性间皮瘤的非特异性的症状及体征，大多数患者得到最初的诊断都是在疾病的晚期［12］，因此迫切需要相关诊断技术及手段的更新提高，以增强早期对疾病做出明确诊断的能力，通过胸水即细胞学诊断是临床常用的诊断方法，减少活检率，进而降低肿瘤种植的风险。然而，即便是有经验的病理医生做出的细胞学诊断，相比较于组织活检，也往往被认为是辅助诊断方法，在这种情况下，加做免疫细胞化学和免疫组织化学染色，对于恶性间皮瘤的诊断，在大多数情况下是足够的［13］。因此，抗体的选择就显得尤为重要。依据国外文献报道，诊断恶性间皮瘤的免疫组织化学抗体应该包括的阳性（间皮）和阴性（癌相关）抗体和至少一个细胞角蛋白（CK）抗体，至少两个间皮标记和至少两个癌相关标记［14］。

CK5/6阳性表达于复层上皮、乳腺及前列腺的肌上皮；鳞癌、上皮样恶性间皮瘤、肺的淋巴上皮瘤样癌，而在腺上皮及其来源的肿瘤、非上皮组织中不表达，临床上主要用于上皮型间皮瘤与肺腺癌、肺鳞癌与肺腺癌等的鉴别诊断。张继贤等［15］用免疫组化检测27例胸膜恶性间皮瘤CK5/6的阳性表达率为77.8%（25/27）。邢荣格等［16］观察了56例恶性间皮瘤CK5/6的阳性表达率为100%（56/56）。本研究CK5/6的阳性表达率为96.83（61/63），特异性敏感性分别为76.92%、96.83%。

MC主要存在于间皮细胞表面，近几年广泛应用于恶性间皮瘤的诊断，临床上常与Calretinin联合应用。研究表明，MC可与CK19等抗体联合应用，提高甲状腺乳头状癌的诊断［17］。陈学敬等［18］用免疫组织化学检测8例恶性间皮瘤患者MC的阳性表达率为82.5%（7/8），本研究发现MC的阳性表达率为100%（63/63），特异 性敏 感性 分别 高达 为90.38%、100%。

Calretinin（CR），主要用于间皮细胞及其发生的肿瘤的诊断及鉴别诊断。常与MC联合应用。邢荣格等［16］检测56例恶性间皮瘤患者，发现CR的阳性表达率为95.3%（53/56），本研究发现CR的阳性表达率为100%（56/56），特异性敏感性分别高达为94.23%、100%。

EGFR是一种跨膜蛋白，表达于多种正常组织，尤其是复层上皮和鳞状上皮，大量研究发现，EGFR的过度表达，与肿瘤的发生、发展、侵袭及转移密切相关，其在上皮性肿瘤的发生发展的过程中发挥着重要作用［4］。Foster等［19］检测 29例恶性间皮瘤患者，发现EGFR的阳性表达率为97%（28/29），本研究发现EGFR的阳性表达率为95.24%（60/63），特异性敏感性分别为59.62%和95.24%。

Vimentin是一种中间丝蛋白，绝大多数间叶源性细胞及其发生的肿瘤均可表达Vim，在恶性间皮瘤中，Vim可表达，尤其是肉瘤样间皮瘤及分化差的双相间皮瘤。陈学敏等［18］用免疫组织化学检测8例恶性间皮瘤患者Vim的阳性表达率为100%（8/ 8），邢荣格等［16］检测56例恶性间皮瘤患者，发现Vim的阳性表达率为80%（45/56），本研究发现Vim的阳性表达率为88.89%（56/63）。

CK7是一种中间丝蛋白，本研究中的阳性表达率为55.56%（35/63）。P53为抑癌基因，研究发现，P53可以抑制人肺腺癌细胞株的生长，促进其凋亡，此外，P53还对判断肺癌病人的预后及复发有非常重要的意义［6］。在肿瘤组织中检测到的均为突变型P53，而在正常组织中不表达，其过表达预示着预后不良。本研究发现P53的阳性表达率为55.56%（35/63）。E-cad是跨膜糖蛋白，其功能的降低或丧失可导致细胞连接破坏，促进肿瘤的浸润与转移。在对肺腺癌的研究中发现，E-cad的过度表达与肿瘤的浸润和转移呈正相关［20］，本研究发现E-cad的阳性表达率为44.45%（28/63）。以上3种抗体对恶性间皮瘤的诊断的阳性表达率不高，特异性敏感性亦明显低于CK5/6.MC.CR.EGFR等抗体，临床上作为首选抗体诊断意义不大。

TTF-1主要表达于胎儿肺组织、成年人Ⅱ型肺泡上皮细胞、甲状腺滤泡细胞。其在原发肺腺癌及转移性肺腺癌的诊断中具有十分重要的作用，现临床上常用其作为肺腺癌的特异性标记物，有研究显示其诊断的特异度可达到100%［7］。本研究显示，TTF-1在恶性间皮瘤中几乎不表达，而在肺腺癌中阳性表达率为92.31%（48/52），特异性敏感性均较高，可作为诊断恶性间皮瘤的阴性对照的首选抗体之一。CEA即癌胚抗原，阳性表达于胎儿肠道、胃肠道腺癌、肺腺癌、甲状腺髓样癌，主要应用于上皮源性转移性肿瘤的鉴别诊断。在恶性间皮瘤中几乎不表达，而在肺腺癌中阳性表达率为94.23%（49/52），特异性敏感性均较高，亦可作为诊断恶性间皮瘤的阴性对照的首选抗体之一。

终上所述，依据各抗体的阳性表达率、特异性及敏感性，CK5/6、MC、CR、EGFR、Vim、TTF-1、CEA可作为诊断恶性间皮瘤最佳首选套餐选择，这些抗体的阳性率在恶性间皮瘤的形态学分型间（粘液型和乳头状型）无明显差别，可不做影响因素考虑，对于胸水沉渣包埋切片HE诊断怀疑恶性的病例，采用该几种免疫组化抗体染色诊断，不仅可以准确诊断恶性间皮瘤，亦可以减少因选择其它阳性率低的抗体进行诊断给患者带来的多余经济负担，因此，该免疫组化套餐的选择对恶性间皮瘤的早期及准确诊断有重要的临床意义。

［1］Sekido Y.Molecular pathogenesis of malignant mesothelioma.Carcinogenesis，2013，34（7）:1413-1419.

［2］肖宁新，黄耀金，石胜。P56和CK5/6在鳞癌组织中的表达及其鉴别诊断价值。中国基层医药，2005，12（4）：444-445.

［3］陈江帆，杜明伟，姜海娇，等。免疫细胞化学方法对胸腔积液中恶性肿瘤细胞的分类与诊断.中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（1）：49-53.

［4］尹光浩，刘伟，刘国津，等。非小细胞肺癌的EGFR表达与EGFR基因突变的比较。中国实验诊断学，2009，12（2）：200-202.

［5］史洪森，周政，田芸，等。上皮钙黏附素与肿瘤转移的研究进展。大连医科大学学报，2005，27（4）：280-282.

［6］高福平，魏谨。P53与肺癌关系的研究进展。临床肺科杂志，2012，17（1）：127-128.

［7］王彩霞，王晓，吕淑慧，等。TTF-1、SP-A在肺腺癌诊断及鉴别诊断中的价值。临床与试验病理学杂志，2008，24（3）：280-283.

［8］罗酩。胃癌患者CEA测定的临床意义。临床医药实践，2010，9（4B）：423-425.

［9］张艳梅，付红，张颖。免疫组化在胸膜上皮性恶性肿瘤鉴别诊断中的价值。中国肺癌杂志，2007，10（4）：320-323.

［10］侯刚，于涓瀚，王秋月，等。临床-影像-病理学评估在恶心胸膜间皮瘤诊断中的价值。中国全科医学，2011，14（10A）：3243-3245.

［11］赵晖。恶性胸膜间皮瘤的治疗进展。中国医药导报，2013（S1）.

［12］Snehal Dabir，Adam Kresak，Michael Yang，et al.CD30 is a potential therapeutic target in malignant mesothelioma. Mol cancer Ther，2015，14（3）:740-746.

［13］Anders Hjerpe，Valeria Ascoli，Carlos Bedrossian，et al. Guidelines for cytopathologic diagnosis of epithelioid and mixed type malignant mesothelioma.Complementary statement from the International Mesothelioma Interest Group，also endorsed by the International Academy of Cytology and the Papanicolaou Society of Cytopathology.Cytojournal，2015，12:26.

［14］Nico van Zandwijk，Christopher Clarke，Douglas Henderson，et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of malignant pleural mesothelioma.J Thorac Dis.2013，5（6）: E254-E307.

［15］张继贤，赵莺，卢韶华。免疫组化对恶性胸膜上皮型间皮瘤与肺腺癌鉴别诊断价值的探讨。中华肿瘤防治杂志，2013，20（3）：221-225.

［16］邢荣格，郭效忠，张欣，等。免疫组化联合抗体在胸膜转移性腺癌与上皮型恶性间皮瘤鉴别诊断中的应用。实用医学杂志，2009，25（23）：3991-3993.

［17］晋龙，眭玉霞，李燕辉。Galectin-3、CK19、MC和CD56在甲状腺微小乳头状癌中的表达及意义。诊断病理学杂志，2012，19（3）：200-202.

［18］陈学敬，周丽娟，曲杨，等。沉渣包埋联合免疫组化在胸水转移性肺腺癌与胸膜恶性间皮瘤鉴别诊断中的应用。诊断病理学杂志，2014，21（5）：263-266.

［19］Foster JM，Gatalica Z，Lillebergs，et al.Novel and existing mutations in the tyrosine kinase domain of the epidermal growth factor receptor are predictors of optimal resectability in malignant peritnoeal mesothelioma.Ann Surg Oncol，2009，16（1）：152-158.

［20］李艳，高习文，颜志军，等。MMP-9、TIMP-1及E-cad在肺腺癌组织中的表达及其与临床病理的关系。安徽医药，2013，17（9）：1510-1512.

Value analysis for application of combined antibodies immunohistochemical detection of pleural effusion cells to diagnose malignant mesothelioma

Ding Chunxiao1，Zhang Yang2，Zhang Heng3，Wang Jian3，Qiao Jujiu1，Li Jianhua3*
（1Department of Pathology，Liaoning Province Chinese Medicine Research Institute，Shenyang 110034；2Department of Pathology，the Fourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031；3Department of Pathology，China Medical University，Shenyang 110013，China）

Objective To Explore the best choice of antibody package in combined immunohistochemical examination of sediment embedded sections of pleural effusion for the diagnosis of malignant mesothelioma.Methods 523 cases of pleural effusion were detected by liquid based cytology，and then pleural effusion specimens of 63 cases of malignant mesothelioma and 52 cases of adenocarcinoma were embedded and sliced after centrifugation sediment.The expression of CK5/6，CK7，TTF-1，Vim，P53，MC，CR，EGFR，E-cad and CEA were detected by immunohistochemistry.We compared the positive expression rate，specificity and sensitivity of these antibodies to explore the best choice for the diagnosis of malignant mesothelioma；at the same time，the results were compared with the clinical results of mucinous type and papillary type malignant mesothelioma，to observe whether the morphological differentiation of malignant mesothelioma influenced the outcome of immunohistochemistry.Results In 63 cases of malignant mesothelioma，the positive expression rates of CK5/6，MC，CR，EGFR，and Vim were higher among the 10 antibodies，while in 52 cases of lung adenocarcinoma TTF-1 and CEA positive rates of expression were the highest；CK5/6，MC，CR，EGFR，Vim，TTF-1，and CEA showed better specificity and（or）sensitivity.Conclusion The best combination of antibodies for the diagnosis of malignant mesothelioma are CK5/6，MC，CR，EGFR，Vim，TTF-1，and CEA.There was no significant difference in the expression rate between mucinous type and papillary type.

Pleural effusion；sediment embedding；malignant mesothelioma；liquid based cytology

R730.26

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-02-16 〔修回日期〕2016-04-23

丁春晓，女（1981年），汉族，主治医师

（To whom correspondence should be addressed）：LIJH@mail.cmu.edu.cn