血浆 miR-193b和 miR-199a在食管癌诊治中的临床价值

齐海亮，齐科雷，宋鑫亮，苏宏伟，杜秀然，王 鹏，李明珠

（河北省胸科医院胸二科，河北石家庄　050041）

·方法研究·

血浆miR-193b和miR-199a在食管癌诊治中的临床价值

齐海亮，齐科雷，宋鑫亮，苏宏伟，杜秀然，王 鹏，李明珠

（河北省胸科医院胸二科，河北石家庄050041）

目的 探讨miRNA-193b和miRNA-199a在血浆中的表达对食管鳞癌的诊治价值。方法 选取2014年9月至2015年6月之间食管鳞癌患者56例，同期健康体检者30例。采用qRT-PCR技术（TaqMan探针法）检测食管鳞癌患者和健康者血浆中miRNA-193b、miRNA-199a的表达水平，以及检测食管鳞癌患者术前、术后1w血浆中miRNA-193b、miRNA-199a的表达水平，并结合临床病理资料，探讨它们与食管鳞癌的关系。结果 食管鳞癌患者血浆中miR-193b和miR-199a的表达量均明显低于健康体检者（P＜0.05）；食管癌患者术后血浆中miR-193b和miR-199a的表达量均明显高于术前（P＜0.05）；血浆中miR-193b的表达与肿瘤TNM分期有关（t=-5.332，P=0.000），表现为随着TNM分期越晚，表达逐渐下调的趋势，与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移无明显关联（P＞0.05）。miR-199a的表达与肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），表现为随着分化程度越低、TNM分期越晚和出现淋巴结转移，表达逐渐下调的趋势，而与患者年龄、性别无明显关联（P＞0.05）。结论 miRNA-193b、miRNA-199a在食管鳞癌患者血浆中表达下调，可能作为抑癌基因参与食管鳞癌的发生发展。

食管鳞癌； 血浆； miRNA-193b； miRNA-199a

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.023

收稿日期：2015-10-07；修回日期：2015-12-25

基金项目：河北省科技支撑计划项目（132777221）

作者简介：齐海亮（1982—），男，主治医师。E-mail：10761119@qq.com

近年来研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）是一类真核细胞中长度为19～25个核苷酸内源性非编码小分子单链RNA，它可以识别靶基因mRNA的3’-非翻译区（3’-UTR），并且能通过抑制翻译及影响mRNA的稳定性而抑制靶基因表达［1］，参与细胞的分化、增殖、凋亡等［2-3］。目前研究已经证实，miRNAs可作为癌基因或抑癌基因调控肿瘤的发生、发展和转移［4］。研究发现，诸多miRNAs与食管癌的发生、发展有着密切联系；然而，miRNA-193b和miRNA-199a在食管鳞癌中是否具有一定的生物学功能，国内外鲜有报道。本研究采用qRT-PCR技术（TaqMan探针法）检测食管鳞癌患者和健康者的血浆中miRNA-193b、miRNA-199a的表达水平，及食管鳞癌患者术前、术后1w血浆中miRNA-193b、miRNA-199a的表达水平，并结合临床病理资料，探讨它们与食管鳞癌的关系。

材料和方法

1 研究对象

1.1食管癌患者 选取2014年9月至2015年6月河北省胸科医院胸外科确诊并行手术治疗的食管鳞状细胞癌患者的外周血，共56例。其中男性36例，女性20例，年龄39～77岁，平均年龄60.2± 11.6岁。每位患者均无其他肿瘤病史，采取外周血标本前及手术前均未行放疗、化疗、生物治疗等任何治疗，所有患者均行手术治疗，术后病理结果均为：食管鳞状细胞癌。依据患者年龄：＜60岁25例，≥60岁31例；依据WHO肿瘤病理学分级：高中分化23例，低分化33例；依据淋巴结有无转移分：无淋巴结转移组（NO）32例，淋巴结转移组（N+）24例；并依据国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）第7版食管癌TNM判定标准进行分期：I+II期40例，III+IV期16例。

1.2健康体检者 收集30例同期健康体检志愿者的外周血，均无肿瘤病史，无高血压、糖尿病、心脏病等慢性病史。男性18例，女性12例，年龄37～ 75岁，平均年龄58.8±10.7岁。与食管癌患者在性别、年龄等一般情况的差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

本研究经过河北省胸科医院伦理委员会审查和批准，全部患者知情并同意。

2 主要试剂

Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司，实时荧光定量PCR检测试剂盒购于美国Promega公司，所有引物均由中国北京赛百盛基因技术有限公司合成。

3 方法

3.1标本采集与处理 分别采集食管癌患者术前、术后1w和健康体检者空腹静脉血2mL，迅速注入EDTA采血管中，于4℃3500×g离心10min，吸取上清悬浮液置入新的EP管中，至于-80℃冰箱中保存待用。

3.2血浆中总的RNA的提取 分别吸取以上血浆样本250μL，加入750μL Trizol试剂，混匀，按照说明书操作，分别加入氯仿、异丙醇等试剂，最终提取总RNA。将1μL RNA液加入DEPC水内，用分光光度仪测定OD260/280吸光值，衡量总RNA纯度，比值在1.8～2.0之间提示提取的总RNA样品纯度较高，用于后续实验。

3.3逆转录反应 按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，反应体系20μL：1.5μL总RNA，特异性茎环反转录引物2μL，Rnase inhibitor（RNA酶抑制剂）1μL，Reaction Buffe（缓冲液）4μL，Reverse Transcriptase（逆转录酶）1μL，10mmol/L dNTP Mix 2μL，DECP Water（DECP水）8.5μL。反应条件：42℃ 60min，25℃ 5min，70℃ 5min，将逆转录反应后产物cDNA，-20℃保存备用。

3.4实时荧光定量PCR 由于血浆miRNA表达量较低，所以先将逆转录产物进行预扩增。按照TaqMan PreAmp Master Mix试剂盒说明书进行预扩增。反应条件：95℃ 10min；55℃2min；72℃2min；95℃ 15s、60℃4min，共12个循环；最后99℃10min。取预扩增产物4μL，按照TaqMan PCR试剂盒说明进行PCR反应。总反应体系20μL。反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸7min。每个样本做3个复孔。记录每个荧光反应管中的荧光信号达到所设定的阈值时所经历的循环数即Ct值，将原始数据取3次重复的平均值，以U6为内参，进行归一化，使用定量PCR中的相对定量法，得出ΔCt，ΔCt= CtmiR-193b或miR-199a-CtU6，以2-ΔCt分别计算食管癌组织和癌旁组织中的miR-193b/miR-199a的相对表达量。

4 统计学处理

用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料采用配对t检验，成组设计的计量资料采用独立样本t检验的方法。采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 食管癌患者和健康体检者的血浆miR-193b、miR-199a表达情况

在食管鳞癌患者术前的血浆中miR-193b表达量为0.022±0.003，而在健康体检者的血浆中表达量为0.039±0.006，食管鳞癌患者血浆中miR-193b表达明显降低，两者存在显著差异，具有统计学意义（t=-25.343，P＜0.001）；而在食管鳞癌患者术前的血浆中miR-199a表达量为0.019±0.002，而在健康体检者的血浆中表达量为0.036±0.004，食管鳞癌患者血浆中miR-199a表达明显降低，两者存在显著差异，具有统计学意义（t=-27.546，P＜0.001）。见表1。经过计算我们发现miR-193b的Cut Off值为0.0305时，其诊断食管鳞癌的敏感度为0.853，特异度为0.763；miR-199a的Cut Off值为0.0265时，其诊断食管鳞癌的敏感度为0.918，特异度为0.835；两者联合检测的敏感度为0.882，特异度为0.894。

表　1 miR-193b和　miR-199a在健康人群和食管鳞癌患者血浆中的表达情况（x±s）

2 食管癌患者血浆miR-193b、miR-199a术前和术后的表达情况

在食管鳞癌患者术后1w的血浆中miR-193b表达量为0.037±0.004，较术前的0.022±0.003，明显升高，两者存在显著差异，具有统计学意义（t= 25.168，P＜0.001）；而在食管鳞癌患者术后1w的血浆中miR-199a表达量为0.035±0.003，较术前的0.019±0.002，明显升高，两者存在显著差异，具有统计学意义（t=45.728，P＜0.001）。见表2。

表　2 在食管鳞癌患者血浆中　miR-193b和　miR-199a术前和术后的表达差异（x±s）

3 miR-193b、miR-199a的表达与临床病理特征之间的关系

3.1miR-193b表达与临床病理特征的关系

通过整理食管癌患者的临床病理资料，发现血浆中miR-193b的表达与肿瘤TNM分期有关（P＜0.05），与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移无明显关联（P＞0.05）。其中III+IV患者的表达量为0.019±0.007，明显低于I+II患者的0.024± 0.004，具有统计学差异（t=5.332，P＜0.001）。见表3。

表3　miR-193b的表达与临床病理特征之间的关系（x±s）

3.2miR-199a表达与临床病理特征的关系通过整理食管癌患者的临床病理资料，发现miR-199a的表达与肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），与患者年龄、性别无明显关联（P＞0.05）。其中低分化患者的表达量为0.017 ±0.005，明显低于高中分化患者的0.019±0.004，具有统计学差异（t=4.434，P=0.003）；III+IV患者的表达量为0.018±0.006，明显低于I+II患者的0.020±0.004，具有统计学差异（t=5.129，P＜0.001）；具有淋巴结转移的患者表达量为0.018± 0.008，明显低于无淋巴结转移患者的0.019± 0.005，具有统计学差异（t=4.294，P=0.002）。详见表4。

表4　miR-199a的表达与临床病理特征的关系（x±s）

讨 论

自从首个miRNA功能被确认以来，miRNA已经成为生命科学研究领域的热点之一。研究发现很多miRNA通过调控肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、死亡、蛋白分解、血管形成等生物程序而参与恶性肿瘤发生发展的过程［5］。miRNAs家族数量巨大，其中许多miRNAs与食管癌有着密切关系。

miR-193b的编码基因在人16号染色体上，它是非编码的小分子RNA，作为一种重要的调节因子，它参与了机体诸多生理病理过程。自200年被首次发现以来，关于它的报道越来越多。有报道［6］指出，在急性髓系白血病细胞中，miR-193b表达明显下降，c-Kit表达升高，两者呈负相关，同时指出调控miR-193b表达，对c-Kit阳性的AML的治疗具有意义。还有研究报道［7］miR-193b在非小细胞肺癌组织中表达下调，当其过表达时可以显著降低A549细胞的增殖、侵袭与转移能力。Li等［8］报道在乳腺癌细胞内下调 miR-193b的表达，可明显增加uPA，进而刺激瘤细胞的恶性表型发生。Lenarduzzi等［9］研究发现在敲除头颈部鳞状细胞癌FaDu细胞系的miR-193b基因，可使癌细胞增殖、侵袭、转移能力提高，并且在体内可以抑制瘤细胞的形成。同样还有其他研究证明，在前列腺癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等细胞、组织、血浆中表达均下调，通过调节靶基因，最终导致肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的主要分子。以上提示miR-193b在多种恶性肿瘤中起到负调控作用，为一种肿瘤抑制因子。在本研究中，我们采用qRT-PCR技术（TaqMan探针法）检测食管鳞癌患者和健康者，及食管鳞癌患者术前、术后1w血浆中miRNA-193b的表达水平，发现食管鳞癌患者血浆中miR-193b的表达量明显低于健康体检者，两者存在显著差异，具有统计学意义（t=-25.343，P ＜0.001）；同时发现食管癌患者术后血浆中miR-193b的表达量明显高于术前，两者存在显著差异，具有统计学意义（t=-26.454，P＜0.001）；而且通过结合患者的临床病理资料，发现miR-193b的表达与肿瘤TNM分期有关（t=-5.332，P＜0.001），表现为随着TNM分期越晚，表达逐渐下调的趋势，而与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移无明显关联（P＞0.05）。本研究提示，miR-193b在食管鳞癌中表现为抑癌基因的作用，当它表达下调时，可能引起某种促癌机制活化，导致食管鳞癌发生、发展、侵袭和转移，但是其发生机制尚不清楚，有待进一步研究。

miR-199a在许多疾病的病理生理过程中发挥了重要的调控作用。在肿瘤方面，miR-199a发挥着双向调控作用。其中，在结直肠癌中miR-199a表达下调可引起肿瘤的发生发展、侵袭，并可激活上皮间质转化（EMT）［10］。Cao等［11］报道miR-199a能通过抑制肿瘤促进因子PAK4的表达，从而阻断PAK4/ Raf/MEK/ERK信号通路，进而抑制肝癌细胞的增殖。Kim等研究发现在肺癌中miR-199a负性调控原癌基因Met，随后证实在前列腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、膀胱癌中同样存在这种负性调控。然而，Song等［12］报道在胃癌组织中发现miR-199a表达明显上调。Lee等［13］在宫颈癌组织中发现miR-199a表达显著上调，并把反义miR-199a寡核苷酸转染入宫颈癌细胞后，阻断miR-199a的表达，则明显抑制癌细胞的生长。然而Pereira等［14］研究中选择U6作为内参，结果提示miR-199a在宫颈癌组织中表达显著下调。因而我们分析，miR-199a在肿瘤组织或细胞的表达与调控作用或许受多种因素影响。在本研究中，我们采用qRT-PCR技术（TaqMan探针法）检测食管鳞癌患者和健康者，及食管鳞癌患者术前、术后1w血浆中miR-199a的表达水平，发现食管鳞癌患者血浆中miR-199a的表达量明显低于健康体检者，两者存在显著差异，具有统计学意义（t=-27.546，P＜0.001）；同时发现食管癌患者术后血浆中miR-199a的表达量明显高于术前，两者存在显著差异，具有统计学意义（t=-24.887，P＜0.001）；而且通过结合患者的临床病理资料，发现miR-199a的表达与肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），呈现为与随着分化程度越低、TNM分期越晚，出现淋巴结转移，表达逐渐下调的趋势，而与患者年龄、性别无明显关联（P＞0.05）。本研究提示我们，miR-199a在食管鳞癌血浆中可能为一种抑癌基因，当其表达下调时，可引起某种促癌机制活化，导致食管鳞癌发生、发展、侵袭和转移，但是其发生机制尚不清楚，有待进一步研究。

综上所述，miR-193b、miR-199a在食管鳞癌的血浆中表达下调，且随着肿瘤的侵及、转移，表达进一步下调，表现为抑癌基因作用，它们或许可作为食管鳞癌诊断中新的标志物，和治疗的全新靶点。本研究中不足之处在于，由于样本量较小，数据存在偏移，而且没有加入返流性食管炎、食管良性肿瘤等相关疾病作为对照，其真正用于临床有待进行进一步研究印证，此外，未明确它们的靶基因和调控机制，有待进一步研究。

［1］Huntzinger E，IzaurraldeE.GenesilencingbymicroRNAs：contributions of translational repression and mRNA decay.Nat Rev Genet，2011，12（2）：99-110.

［2］Cohn D E，Fabbri M，ValeriN，etal.Comprehensive miRNA profiling of surgically staged endometrial cancer.Am J Obstet Gynecol，2010，202（6）：656.

［3］Zimmerman A L，Wu S.MicroRNAs，cancer and cancer stem cells. Cancer Lett，2011，300（1）：9-10.

［4］He L，Thomson J M，Hemann M T，et al.A micro RNA polyeistron as a potential human oncogene.Nature，2005，435（7043）：828 -833.

［5］Blenkiron C，Miska E A.miRNAs in cancer：approaches，aetiology，diagnostics and therapy.Hum Mol Genet，2007，16（1）：106-113.

［6］Gao X N，Lin J，Gao L，et al.MicroRNA-193b regulates c-Kit proto-oncogene and represses cell proliferation in acute myeloid leukemia.Leuk Res，2011，35（9）：1226-1232.

［7］Hu H J，Li S G，LiuJ，etal.MicroRNA-193bmodulates proliferation，migration and invasion of non-small cell lung cancer cells.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2012，44（5）：424-430.

［8］Li X F，Yan P J，ShaoZM.DownregulationofmiR-193b contributes to enhance urokinase-type plasminogen activator（uPA）expression and tumor progression and invasion in human breast cancer.Oncogene，2009，28（44）：3937-3948.

［9］Lenarduzzi M，Hui A B，Alajez N M，et al.MicroRNA-193b enhances tumor progression via down regulation of neurofibromin I. PLoS One，2013，8（1）：e53765.

［10］Hu Y，Liu J，Jiang B，et al.MiR-199a-5p loss up-regulated DDR1 aggravated colorectal cancer by activating epithelial-to-mesenchymal transition related signaling.Dig Dis Sci，2014，59（9）：2163-2172.

［11］Hou J，Lin L，Zhou W，et a1.Identification of miRNA-mes in human liver and hepatecellular carcinoma reveals miILNA-99a/b-3p as ther-apeutic target for hepatecdlular carcinoma.Cancer Cell，2011，19（2）：232-243.

［12］Song G，Zeng H，Li J，et al.miR-199a regulaates the tumor suppressor mitegen-activated protein kirmse 11 in gastric cancer. Biol Pharm Bull，2010，33（11）：1822-1827.

［13］Lee J W，Choi C H，Choi J J，et al.Altered microRNA expression in cervical carcinomas.Clin Cancer Res，2008，14（9）：2535-2542.

［14］Pereira P M，Marques J P，Soares A R，et al.MicroRNA expression variabilityinhumancervicaltissues.PLoSOne，2010，5 （7）：e11780.

（潘子昂编辑）

Clinical Value of Plasma miR-193b and miR-199a in the Diagnosis and Treatment of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

QI Hai-liang，QI Ke-lei，SONG Xin-liang，SU Hong-wei，DU Xiu-ran，WANG Peng，LI Ming-zhu
（Department of Thoracic Surgery，Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang 050041，China）

Objective To investigate the value of miRNA-193b and miRNA-199a in the diagnosis and treatment of esophageal squamous cell carcinoma.Methods 56 cases of esophageal squamous cell carcinoma and 30 cases of healthy physical examination were selected.MiRNA-193b and miRNA-199a expression levels in esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy persons were detected by qRT-PCR technique，and the expression levels of miRNA-199a and miRNA-193b in plasma of patients with esophageal squamous cell carcinoma before and after operation were detected.Results The expression of plasma miR-199a and miR-193b in patients with esophageal squamous cell carcinoma was significantly lower than that of healthy controls（P＜0.05）.The expression of plasma miR-199a and miR-193b in patients with esophageal carcinoma after operation was significantly higher than that of the preoperative expression（P＜0.05）.The expression of miR-193b in plasma was related to TNM staging（P=0.000，t=-5.332），and gradually decreased with the TNM staging.It had no significant association with age，gender，tumor differentiation and lymph node metastasis（P＞0.05）.The expression of miR-199a was related to the tumor differentiation，TNM stage and lymph node metastasis（P＜0.05），and gradually decreased with the lower differentiation degree，TNM staging，lymph node metastasis.Ithad no significant association with age and gender of patients（P＞0.05）.Conclusion The expression levels of miRNA-193b and miRNA-199a in the plasma of patients with esophageal squamous cell carcinoma is downregulated.It may act as a tumor suppressor gene involved in the development of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma； Plasma； miRNA-193b； miRNA-199a