副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6发酵提取物对鲜虾的保鲜评价

陈飞龙，苗建银，2，廖玮灵，彭　勃，曹　庸，2，*（.华南农业大学食品学院，广东广州50642；2.广东省天然活性物工程技术研究中心，广东广州50642）

副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6发酵提取物对鲜虾的保鲜评价

陈飞龙1，苗建银1，2，廖玮灵1，彭勃1，曹庸1，2，*
（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；
2.广东省天然活性物工程技术研究中心，广东广州510642）

将经过0.5%FX-6发酵提取物浸泡处理的鲜虾于4℃冷藏，隔天测定其pH、TVB-N值、细菌总数等鲜度指标及进行感官评价。同时，以相同浓度的山梨酸钾、乳酸链球菌素为阳性对照组。实验结果表明：随着鲜虾冷藏时间的延长，其pH、TVB-N值、细菌总数等鲜度指标均出现不同程度的上升，以TVB-N值为25 mg/100 g和菌落总数为106CFU/g作为判断货架期终点的界限，空白对照组冷藏第6 d时其TVB-N值和菌落总数已超过界限，0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素组第8 d时超过界限，而0.5%FX-6发酵提取物组则在第10 d时才超过界限。因此，综合各项鲜度指标及感官评分可知，经过0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素处理后的鲜虾的货架期可由4 d延长至6 d，而0.5%FX-6发酵提取物能够延长鲜虾货架期至8 d。说明0.5%FX-6发酵提取物对鲜虾具有较好的保鲜效果，优于0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素。

发酵提取物，抗菌谱，鲜虾，保鲜

副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6是从西藏开菲尔中筛选分离得到的一株新型菌株，其发酵提取物的抗菌活性强且抗菌谱广［1-2］。前期研究［3-4］发现FX-6发酵提取物在牛奶、馒头及冷鲜肉中具有很好的防腐保鲜效果，不仅能够有效抑制微生物的生长，保持食品的良好品质，还不会带来食品安全性问题。因此，安全、天然、高效、广谱的FX-6发酵提取物在食品防腐保鲜领域中极具应用前景。

虾是我国最重要的水产品之一，它最重要的品质指标是新鲜度，但其高蛋白、高水分的特征使其容易腐败变质。如今，鲜虾的防腐保鲜剂大多数为化学防腐保鲜剂，如金霉素、山梨酸钾、醋酸钠等，而长期或过量使用化学防腐保鲜剂会导致微生物耐药、化学防腐保鲜剂残留、食品品质改变等问题，存在食品安全隐患，不能满足人们对高品质鲜虾的要求，从而寻找一种安全、天然、高效、广谱的新型防腐保鲜剂已成为对鲜虾保鲜的研究热点。本文采用氯化三苯基四氮唑法测定FX-6发酵提取物的最低抑菌浓度，并通过测定微生物指标、理化指标及感官指标，评价其在鲜虾的储存过程中的防腐保鲜效果，为其作为一种新型食品防腐保鲜剂的开发应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

鲜虾购自广州五山花园泽生市场；FX-6发酵提取物实验室自制［4］，保存于4℃冰箱；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、苏云金芽孢杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌、哈维氏孤菌、铜绿假单胞菌食品学院微生物实验室保藏；LB肉汤培养基、PCA培养基广东环凯微生物科技有限公司；氯化三苯基四氮唑上海源聚生物科技有限公司；硫酸卡拉霉素北京普博欣生物科技有限责任公司；乳酸链球菌素（尼生素） 浙江新银象生物工程有限公司；山梨酸钾天津市科密欧化学试剂有限公司；PBS缓冲液武汉博士德生物工程有限公司。

FE20型实验室pH计、PL203型电子天平梅特勒托利多仪器有限公司；LC-15C型高效液相色谱仪、UV-VIS型紫外可见光分光光度计岛津仪器（苏州）有限公司；YXQ-LS-50A高压灭菌器上海申安医疗器械有限公司；SW-CJ-1G型单人净化工作台上海雷韵实验仪器制造有限公司；L-530型台式低速离心机湖南湘仪仪器有限公司；TDL-5型台式离心机上海安亭科技仪器厂；RE-52AA型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；FD-1PF型立式冷冻干燥机北京德天佑科技发展有限公司；DH500BII型电热恒温培养箱天津市泰斯特仪器有限公司；IMS-70型雪花制冰机常熟雪科电器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1FX-6发酵提取物最低抑菌浓度的测定选用氯化三苯四氮唑作为抗菌药物抗菌活性的指示剂［5］。具体操作为［6］：先将配制好的FX-6发酵提取物母液转移到96孔板第11列（样品对照孔）板孔中，每孔加入100 μL。取对数生长期的待测菌液，4000 r/min离心5 min收集菌体，PBS缓冲液清洗3次后，用新鲜无菌的LB培养基重悬至1×108CFU/mL，接着将其转移到第1至10列（样品测试孔）和第12列（生长对照孔）板孔中，每孔加入100 μL。然后，将100 μL待测样品母液加入到第1列的板孔中，混匀后从第1列取出100μL转移到第2列，如此类推，直到第10列，第10列取出的100 μL丢弃。最后，每孔加0.5%氯化三苯四氮唑指示剂5 μL混匀，用于指示细菌生长与否。每行可做一个样品，加样后加盖振荡1 min，于37℃培养箱培养6～8 h，有活性的标志为无颜色变化，有菌生长者其颜色呈粉红色。发生颜色变化的最低稀释浓度为待测物质的最低抑菌浓度，同时，分别用等体积的无菌水、硫酸卡拉霉素代替FX-6发酵提取物母液做阴性对照、阳性对照。

1.2.2FX-6发酵提取物在鲜虾中的防腐保鲜评价

1.2.2.1实验分组及前处理选取鲜活、完整、颜色鲜亮、大小均一的鲜虾，剔除死亡损伤个体，鲜虾浸入冰水（1∶2，w/v）中冻死后，用蒸馏水洗净并沥干，随机分组，分组情况具体见表1。将分组处理之后的鲜虾分别装入保鲜袋中，然后将保鲜袋置于保鲜盒内，最后将保鲜盒置于4℃冰箱中储存。于0、2、4、6、8、10 d取样，每次每组取样10只，每组样品平行测定3次。

1.2.2.2感官品质评价根据《SC/T 3113-2002冻虾》［7］的要求稍做修改，制定感官评分表，具体如表2。选定10名接受过严格的感官评定培训、并具有感官评定经验的人员根据感官评分表进行感官评分。

1.2.2.3鲜虾pH的测定［8］取5 g虾肉加入45 mL蒸馏水进行匀浆，4000 r/min离心5 min后取上清液，用pH计测定其pH。

1.2.2.4鲜虾TVB-N值测定根据《SC/T 3032-2007水产品中挥发性盐基氮的测定》［9］的方法进行测定。

1.2.2.5鲜虾菌落总数的测定根据《GB/T 4789.2-2010食品微生物学检验菌落总数测定》［10］的方法进行测定。

1.2.3数据分析以上测定的pH、TVB-N值、菌落总数指标及感官评分，运用SPSS Statistics 17.0，进行方差分析和Duncan方法分析（p＜0.05）。

2　结果与讨论

2.1FX-6发酵提取物最低抑菌浓度的测定

以氯化三苯四氮唑作为抗菌药物抗菌活性的指示剂，测定FX-6发酵提取物对常见食源性致病菌及水产致病菌的最低抑菌浓度。经多次重复实验，FX-6发酵提取物的最低抑菌浓度结果如表3所示。

由表3可知，FX-6发酵提取物对常见食源性致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌）和常见的水产致病菌（嗜水气单胞菌、哈维氏孤菌）具有很强的抑制作用，同时FX-6发酵提取物的前期研究［2］发现其对霉菌也有很强的抑制作用，并具有较好的酸碱、酶解耐受性和光、热稳定性，这都为FX-6发酵提取物在鲜虾中的应用奠定了良好的基础。

表1　实验处理分组情况Table 1　Experimental treatment group

表2　感官评分表Table 2　Sensory evaluation criteria for shrimp

表3　FX-6发酵提取物对不同微生物的最低抑菌浓度（，n=3）Table 3　The MIC values of microbes inhibited by FX-6 fermented extracts（，n=3）

表3　FX-6发酵提取物对不同微生物的最低抑菌浓度（，n=3）Table 3　The MIC values of microbes inhibited by FX-6 fermented extracts（，n=3）

指示菌　MIC（mg/mL）金黄色葡萄球菌（Staphylpcoccus aureus）　5.15±0.22大肠杆菌（Escherichia coli）　4.85±0.25沙门氏菌（Salmonella typhimurium）　5.00±0.18痢疾贺志杆菌（Shigella dysenteriae）　4.96±0.19苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）　3.95±0.11嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）　6.25±0.22哈维氏孤菌（Vibrio harveyi）　3.13±0.12铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）　4.00±0.23

2.2FX-6发酵提取物在鲜虾中的防腐保鲜评价

2.2.1感官评价食品的感官评价，如外形、色泽、滋味、气味等是描述和判断产品质量最直观的指标。感官评分既体现了食品享受性和可食用性，又反映了食品安全性和品质［11-12］。如图1所示，在鲜虾冷藏最开始的时候，各组的感官评分基本一致，说明添加0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物都不会对鲜虾的感官产生负面影响。随着贮藏时间的延长，四组样品的感官评分都越来越低，而空白对照组下降的速度显著高于其他实验组（p＜0.05）。在冷藏第6 d的时候，空白对照组感官评分为10.8分，而0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5% FX-6发酵提取物组的感官评分分别为20、20.45、24分，其中FX-6发酵提取物组的鲜虾还处于一级鲜度。到第8 d时，只有0.5%FX-6发酵提取物组处于二级鲜度，其感官评分为20.5分，而0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素组已腐败变质。冷藏至第10 d，四组样品的分数均降至18分以下，说明四组鲜虾均已腐败，感官评分结束。因此，经0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素浸泡处理后能使鲜虾感官可接受的时间由4 d延长至6 d，而经0.5%FX-6发酵提取物浸泡处理后，鲜虾感官可接受的时间延长至8 d，即FX-6发酵提取物组的保鲜效果要优于其他实验组。

2.2.2鲜虾在冷藏过程中pH的变化pH是反映虾肉新鲜程度的指标之一，蛋白质在微生物和酶的作用下分解产生碱性含氮物质会使pH升高。空白对照、0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物组鲜虾样品在冷藏过程中pH的变化如图2所示，随着冷藏时间的延长，四组样品的pH都逐渐升高，但空白组升高得最快，与其他三组有显著差异（p＜0.05）。说明添加0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物能够有效地抑制微生物的生长，降低了蛋白质的分解速度，减缓pH的上升的速度，延长了鲜虾的货架期。

图1　鲜虾在冷藏过程中感官评分的变化Fig.1　Changes in sensory evaluation of shrimp during storage

图2　鲜虾在冷藏过程中pH的变化Fig.2　Changes in pH of shrimp during storage

2.2.3鲜虾在冷藏过程中TVB-N值的变化挥发性盐基氮（TVB-N）是蛋白质在微生物和酶的作用下降解而产生的氨和胺类等碱性含氮物质的总称，是判断食品品质的依据之一。从图3可知，鲜虾冷藏第0 d时，各组的可挥发性盐基氮的含量相差不大，然而随着冷藏时间的延长，四组的TVB-N值都不断增加，其中空白对照组升高速度明显最快并始终大于0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物组（p＜0.05）。根据《SC/T 3113-2002冻虾》［7］，海水虾TVB-N值的限值是25 mg/100 g，空白对照组在第4 d时，TVB-N值为24.18 mg/100 g，接近安全限值，鲜虾即将腐败变质。第6 d时，空白对照组TVB-N值为32.48 mg/100 g，超过安全限值，鲜虾已经腐败变质。此时，0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5% FX-6发酵提取物组的TVB-N值分别为23.24、22.96、19.6 mg/100 g，未超过25 mg/100 g，鲜虾未腐败变质。第8 d时，0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素组的TVB-N值都已超过25 mg/100 g，而0.5%FX-6发酵提取物组TVB-N值为24.08 mg/100 g，在安全限值之内，说明0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物够较好地抑制微生物过快繁殖，抑制蛋白质的降解生成氨以及胺类等碱性含氮物质，从而TVB-N值上升的速度减小，但0.5%FX-6发酵提取物的抑制作用比添加了0.5%山梨酸钾及0.5%乳酸链球菌素的更强。

图3　鲜虾在冷藏过程中TVB-N值的变化Fig.3　Changes in TVB-N of shrimp during storage

2.2.4鲜虾在冷藏过程中菌落总数的变化鲜虾在冷藏过程中菌落总数的变化如图4所示，与空白对照组相比，其他实验组微生物的生长受到显著抑制（p＜0.05）。一般来说，鲜虾菌落总数（CFU/g）≤105为一级鲜度，≤5×105为二级鲜度，菌落总数达到106CFU/g时，通常虾已腐败，不能食用，此时断定为货架期终点［13］。空白对照组的菌落总数在第6 d时已增长为4.4× 106CFU/g，远远高于106CFU/g，而第4 d时≤106CFU/g说明冷藏鲜虾的货架期仅为4 d。到第6 d时，0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物组的菌落总数分别是3.86×105、3.00×105、2.52×105CFU/g，而到第8 d时，0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物组的菌落总数分别是1.48×106、2.84×106、6.00×105CFU/g，说明添加了0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素的鲜虾货架期能够延长到6 d，而添加0.5%FX-6发酵提取物的鲜虾货架期能够延长至8 d。因此，0.5%FX-6发酵提取物对鲜虾的保鲜效果明显优于0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素。

图4　鲜虾在冷藏过程中细菌总数的变化Fig.4　Changes in total bacterial count of shrimp during storage

综上所述，鲜虾在冷藏过程中，感官评分、pH、TVB-N和菌落总数的变化趋势基本一致，TVB-N值为25 mg/100 g和菌落总数为106CFU/g作为判断货架期终点的界限。由空白对照组可知，鲜虾的货架期为4 d，添加了0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素之后，鲜虾的货架期能够延长至6 d，而添加0.5%FX-6发酵提取物能够将鲜虾的货架期延长至8 d。因此，0.5%FX-6发酵提取物对鲜虾的保鲜效果明显优于0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素，具有很好的应用前景。

殷邦忠［14］、李蕾蕾等［15］发现鲜虾在冷藏过程中优势腐败菌是革兰氏阴性菌，主要为假单胞菌、气单胞菌。本文采用的乳酸链球菌素［16］对大部分革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，但是只对少数革兰氏阴性菌有抑制作用，并且乳酸链球菌素在碱性条件下不稳定。由图3可知，0.5%乳酸链球菌素组的鲜虾在冷藏第4 d时，TVB-N值出现明显的转折点，可能是因为pH上升导致乳酸链球菌素的抑菌活性下降。随时间的延长，鲜虾在冷藏过程中的优势腐败菌革兰氏阴性菌不断繁殖，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质不断累积，pH上升，从而使乳酸链球菌素保鲜效果逐渐减弱，因此，乳酸链球菌素组的保鲜效果相对较差。而FX-6发酵提取物既对革兰氏阳性菌有很强抑制作用又对革兰氏阴性菌有很显著的抑制效果，并且具有较好的酸碱、酶解耐受性和光、热稳定性，从而可以有效地抑制鲜虾冷藏过程中腐败菌的生长繁殖，达到较好保鲜效果。

3　结论

3.1FX-6发酵提取物抗菌谱广，它能够对常见的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等食品致病菌特别是对嗜水气单胞菌、哈维氏孤菌等水产致病菌有很强的抑制作用，这为其在水产品中的应用提供了良好的基础。

3.2将鲜虾分为空白对照、0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素、0.5%FX-6发酵提取物组，然后隔天对鲜虾样品进行感官评价及pH、TVB-N值和细菌总数的测定，从而验证并比较相同浓度下山梨酸钾、乳酸链球菌素、FX-6发酵提取物对鲜虾保鲜的效果。实验发现，添加了山梨酸钾、乳酸链球菌素、FX-6发酵提取物均能显著延长鲜虾的货架期（p＜0.05），但0.5%FX-6发酵提取物的保鲜效果优于0.5%山梨酸钾、0.5%乳酸链球菌素的保鲜效果，0.5%FX-6发酵提取物能够延长鲜虾的货架期4 d，而山梨酸钾、乳酸链球菌素只能延长2 d，说明FX-6发酵提取物在鲜虾中具有很好的防腐保鲜效果。

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Preservation of Lactobacillus paracasei subsp.tolerans FX-6 fermented extracts on shrimp

CHEN Fei-long1，MIAO Jian-yin1，2，LIAO Wei-ling1，PENG Bo1，CAO Yong1，2，*
（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Guangdong Engineering Research Center of Natural Active Substance，Guangzhou 510642，China）

The total bacterial count，pH value，content of total volatile basic nitrogen（TVB-N）and sensory evaluation were measured，the preservative effects of distilled water，0.5%FX-6 fermented extracts，0.5%potassium sorbate and 0.5%nisin on shrimp were investigated respectively during storage at 4℃.The results showed that the total bacterial count，pH value and TVB-N of shrimp increased during storage，the TVB-N of 25 mg/100 g and the total bacterial count of 106CFU/g could be adopted to judge the end of shelf-life.The shrimp of distill water group reached the edible limit of 25 mg/100 g and 106CFU/g at day 6，the 0.5% potassium sorbate and 0.5%nisin group reached the edible limit at day 8，however，the 0.5%FX-6 fermented extracts group reached the edible limit at day 10.Therefore，the 0.5%potassium sorbate and 0.5%nisin could extend the shelf life of shrimp 2 d，but the 0.5%FX-6 fermented extracts could extend the shelf life of shrimp 4 d.The 0.5%FX-6 fermented extracts had better fresh-keeping effects on shrimp than 0.5%potassium sorbate and 0.5%nisin.

fermented extracts；antibacterial spectrum；shrimp；preservation

TS254.4

A

1002-0306（2016）04-0351-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.062

2015－08－19

陈飞龙（1992-），男，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：feilong42@163.com。

曹庸（1966-），男，博士，教授，研究方向：食品化学与营养，E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn。

国家自然科学基金资助项目（31171768）；广东省教育厅科研项目（2013gjhz0003）。