复合酶辅助浸提绿茶多酚工艺条件优化

郑生宏，缪叶旻子，严 芳，邵静娜，何卫中（浙江省丽水市农业科学研究院，浙江丽水323000）

复合酶辅助浸提绿茶多酚工艺条件优化

郑生宏，缪叶旻子，严 芳，邵静娜，何卫中*
（浙江省丽水市农业科学研究院，浙江丽水323000）

采用纤维素酶+果胶酶的复合酶法在较适温度下辅助浸提绿茶多酚，以茶多酚浸提率为考察指标，通过单因素和正交实验优化了酶添加量、料液比、浸提温度和浸提时间等四个浸提条件因素，确定了最佳浸提工艺条件为：纤维素酶和果胶酶分别添加0.3%，料液比1∶40 g/mL，浸提温度50℃，浸提时间45 min；在此条件下茶多酚浸提率可达21.36%，明显高于传统水提法的茶多酚浸提率17.41%。

复合酶解，茶多酚，浸提，条件优化

茶多酚（TP）是茶叶中重要的次级代谢产物之一，约占茶鲜叶干重的18%～36%，对机体的活性氧自由基和脂类自由基具有较强的清除能力，其还具有防癌抗癌、杀菌抑菌、抗过敏、抗辐射等作用［1］，已被列为食品添加剂，在食品加工、医药、农业、日用化工等领域均有重要应用［2-4］。近年来提取茶多酚的主要方法包括溶剂提取法、离子沉淀法、柱层析法、超临界萃取法、色谱法、超声波法、微波法、酶法等［5］。这些方法主要都是通过有机溶剂（通常为乙醇）或者水在一定的条件下将茶多酚从细胞内浸提至溶剂中，然后采用物理或化学方法将其从浸提液中分离出来，因而茶多酚的提取可以归纳为浸提工序和分离工序两个步骤。上述的茶多酚提取方法中，包括离子沉淀法、柱层析法以及色谱法的优势主要体现在分离工序，而溶剂浸提法、超临界萃取法、超声波法、微波法和酶法的优势主要体现在浸提工序，这其中超临界萃取法因设备成本高且浸提率较低而很少使用［6］，而超声波法、微波法和酶法可以看成是溶剂萃取法的辅助改进方法，能够大大改善溶剂浸提法存在的周期长、浸提率较低等不足，成为目前研究的热点之一［7-11］。而相较于超声波法和微波法，酶法辅助浸提具有反应条件温和，有效成分浸提率高等优点，又由于酶法提取是在非有机溶剂中进行，使得提取产物纯度、稳定性、活性都较高，无污染，解决了有机溶剂提取法中，有机溶剂残留及回收困难且乙醇用量大等缺点；此外，酶法提取在缩短浸提时间、降低能耗、降低提取成本等方面也具有一定的优势。目前采用酶法提取，尤其是复合酶法提取茶多酚较少见诸报道［12-13］。基于此，本研究选用纤维素酶+果胶酶的复合酶辅助浸提绿茶中茶多酚，利用该复合酶在较适温度下分解构成细胞壁及细胞间质的纤维素和果胶，从而提高茶多酚的溶解率和提取率。研究通过单因素和正交实验优化复合酶浸提茶多酚工艺条件参数，以期最大限度提高茶多酚浸提率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丽水香茶 丽水市碧云天茶叶有限公司；纤维素酶（酶活10万U/g）、果胶酶（酶活5万U/g） 均购于江苏锐阳生物科技有限公司；磷酸氢二钠、柠檬酸、福林酚、碳酸钠等 均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

JFSD-100粉碎机 上海嘉定粮油仪器公司；HH-6电热恒温水浴锅 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；PB-10酸度计 北京赛多利斯仪器系统有限公司；722N型可见分光光度计 优尼科仪器有限公司；AB104-N电子分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶多酚的提取 分别称取3 g茶叶粉碎样（精确至0.0001 g），加入若干纯水和复合酶，搅拌均匀，根据前期实验，复合酶选定为1∶1的纤维素酶：果胶酶。在酸度计下用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调pH 至5.0（折中选取），然后在一定的温度和时间下水浴浸提，过滤，取滤液备用。

丽水香茶→粉碎样→过筛（40目）→酶解辅助浸提→抽滤→滤液→含量测定

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 酶添加量单因素实验 精确称取同一批次茶叶粉碎样3 g于5个三角瓶中，料液比1∶20 g/mL，在酶解温度50℃，浸提时间40 min的条件下，考察不同酶添加量对丽水香茶茶多酚浸提率的影响。酶添加量分别设置为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（分别表示纤维素酶和果胶酶总添加量）共五个梯度。

1.2.2.2 料液比单因素实验 精确称取3 g茶叶粉碎样5份置于三角烧瓶中，分别加入质量分数为0.4%复合酶，在酶解温度50℃，浸提时间40 min的条件下，考察不同料液比对茶多酚浸提率的影响。实验中，分别设置料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL共五个不同配比。

1.2.2.3 浸提温度单因素实验 精确称取3 g茶叶粉碎样5份置于三角烧瓶中，结合上述实验结果，在酶添加量0.4%，料液比1∶40 g/mL的条件下，考察不同浸提温度对茶多酚浸提率的影响，其中温度设置为30、40、50、60、70℃共5个梯度进行比较实验。

1.2.2.4 浸提时间单因素实验 精确称取3 g茶叶粉碎样5份置于三角烧瓶中，分别按重量比0.4%加入纤维素酶和果胶酶，在料液比1∶40 g/mL，浸提温度50℃的条件下，考察不同浸提时间对茶多酚浸提率的影响。浸提时间设置为30、45、60、75、90 min共5个水平。

1.2.3 正交实验 在上述单因素实验结果基础上，以减少实验次数和寻求最佳参数组合，选择复合酶添加量、料液比、浸提温度、浸提时间共4个因素，各因素设置3个水平，按照L9（34）正交表进行实验设计，实验因素及水平见表1。

1.2.4 茶多酚含量的测定 参照文献［14］。

1.2.4.1 没食子酸标准曲线绘制 移取0.1 mg/mL没食子酸标准溶液于容量瓶中，加入2 mL Folin-酚试剂，反应3 min，加4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，定容至100 mL，静置1 h，于765 nm测定吸光度。

表1 酶法浸提茶多酚正交实验因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal test for TP extraction with composite-enzymolysis

1.2.4.2 茶多酚浸提率的计算 准确量取样品溶液

1 mL，加入2 mL Folin-酚试剂，反应3 min，加4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，摇匀定容至100 mL，静止1h，

765 nm下测定其吸光度，并按下式计算茶多酚含量。

式中：A：样品液吸光度；V：提取液体积，mL；d：稀释因子；SLOPEstd：没食子酸标准曲线的斜率；m：样品干物质含量，%；m1：样品质量，g。

1.3 数据处理

茶多酚提取实验数据、图表处理在Excel 2003中进行，正交实验采用DPS软件设计分析。每次实验均进行三次平行实验，实验结果用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以没食子酸标准液浓度为横坐标，没食子酸标准液吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图1），得回归方程为：y=0.1711x+0.0004，R2=0.9993，表明没食子酸在0～1.0 mg/mL范围内线性关系良好。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1 酶法浸提条件单因素实验

2.1.1 酶添加量对茶多酚浸提率的影响 由图2可知，酶添加量在0.2%～0.4%之间时，茶多酚浸提率随着酶添加量的增加而增加。这是由于纤维素酶和果胶酶可破坏茶叶的细胞壁与细胞间质，促使茶多酚等胞内物质快速扩散溶出，提高茶多酚等有效成分的浸提率。在达到0.4%以后，随着酶添加量的继续增加，茶多酚浸提率基本保持不变，说明添加量在0.4%

时，酶解反应完全，茶多酚已充分浸提出来，继续增加对浸提率影响不大。基于此，选用质量分数0.4%作为最适酶添加用量进行后续单因素实验。

图2 酶添加量对茶多酚浸提率的影响Fig.2 Effect of enzyme contents on extraction rate of TP

2.1.2 料液比对茶多酚浸提率的影响 由图3可知，随着料液比在1∶20～1∶60 g/mL范围内不断增加，茶多酚浸提率呈现出先增加后下降的变化趋势，当料液比在1∶20～1∶40 g/mL之间时，随着料液比的增加，茶多酚浸提率也相应增加；在达到1∶40 g/mL后，随着料液比的继续增加，茶多酚浸提率呈现出不断下降的趋势。这可能是由于随着料液比的增加，体系中酶的浓度相应在不断减小，致使酶活相对降低，从而导致复合酶水解纤维素和果胶质能力有所减弱，最终使得茶多酚浸提率不断下降。因而，采取料液比1∶40 g/mL浸提效果较好。

图3 料液比对茶多酚浸提率的影响Fig.3 Effect of solid-to-liquid rate on extraction rate of TP

2.1.3 浸提温度对茶多酚浸提率的影响 从图4可以看出，在所选的实验温度30～50℃范围内，随着浸提温度的不断提高，茶多酚浸提率也在不断提高，且在50℃达到最大值，因而该温度是整个酶体系最适作用温度。50℃以后，随着温度继续增加，茶多酚浸提率不断下降。该结果说明在未达到最适作用温度之前，升高温度能促进酶解作用，使酶对细胞壁的破坏作用加强，进一步促使有效成分向细胞外扩散，升温还能提供酶解反应所需能量，因而茶多酚浸提率在该温度段不断提高。之后，继续提高温度，致使具有蛋白质属性的部分乃至全部酶超过其最适作用温度而逐渐失活，从而酶促反应受到抑制。综上，在温度为50℃时，酶的活性能够得到充分发挥，茶多酚浸提率达到最大，因此，选取50℃为最适浸提温度。

图4 浸提温度对茶多酚浸提率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of TP

2.1.4 浸提时间对茶多酚浸提率的影响 由图5可知，在所选时间段内，茶多酚浸提率随着浸提时间的延长而呈现出先增加后下降而后基本保持不变的变化趋势，在45 min中范围内，茶多酚浸提率呈直线上升，说明随着时间的延长，酶的活力充分得到发挥，酶解反应进行得较完全；45 min后，茶多酚浸提率有一定程度的下降，其原因可能是由于体系中已溶出的部分茶多酚发生了氧化聚合反应而转变为其他物质，导致茶多酚含量减少；同时一些复合酶解产物，如花色素、单宁等本身就是纤维素酶的天然抑制剂，在溶液中浓度的累积也会对酶解反应造成抑制。综上实验结果，并非浸提时间越长越好，当浸提时间达到45 min时，茶多酚浸提率达到最大，因此，45 min为最佳酶解时间。

图5 浸提时间对茶多酚浸提率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of TP

2.2 酶法浸提茶多酚正交优化实验

由极差结果分析可知，料液比对茶多酚浸提率影响最大，其后依次为浸提时间、酶添加量和浸提温度，最优参数组合为A3B2C2D2，即在酶添加量0.6%、浸提温度50℃、料液比1∶40 g/mL、浸提45 min条件下，茶多酚浸提率最高。在此条件下对酶解法浸提茶多酚进行验证实验，同时以传统水提法［15］为对照，3次平行，结果表明（表3）在最佳参数组合下，茶多酚浸提率达21.36%，均高于单因素实验和正交实验结果，表明此工艺具有一定的合理性。同时，与对照的传统水提法相比，酶法茶多酚浸提率高出22.7%，且其条件温和高效，操作简单，因此复合酶解提取茶多酚是一种安全可靠的提取方法，具有很好的应用前景。

表2 正交实验结果Table2 Results of orthogonal test by enzymolysis-assisted extraction

3 结论

选用纤维素酶和果胶酶的复合酶系对丽水香茶这一大宗绿茶进行茶多酚浸提实验，通过单因素和正交实验优化了酶法辅助浸提茶多酚条件参数，得到的最佳浸提条件为：复合酶添加量0.6%，料液比1∶40 g/mL，浸提温度50℃，浸提时间45 min；在此条件下，茶多酚浸提率可达21.36%，明显高于传统水浸提法的茶多酚浸提率17.41%，且与传统水提法相比，本复合酶解法还具有如下两个优点，一是复合酶解法具有高效温和、节能环保的优点，完全可以克服传统水提法因在相对高温长时条件下2次浸提茶叶中的茶多酚，致使浸提不充分、茶多酚尤其是儿茶素易氧化生成茶色素，与体系中咖啡碱、蛋白质生成茶乳酪，影响茶多酚的生物活性等不足。二是酶解法能促进茶叶内不利及无效成分的有益转化，改善茶汤的色、香、味、形及营养价值等综合品质，因而使得该法不仅局限于茶多酚的提取，而且可以作为改善风味和品质的方法之一应用于茶饮料生产，其应用前景可观。

表3 复合酶浸提法与传统水提法比较Table3 Comparison on extraction rate of TP between enzymolysis and boiling water

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Optimizing of composite-enzymolysis assisted extraction process of green tea polyphenols

ZHENG Sheng-hong，MIAOYE Min-zi，YAN Fang，SHAO Jing-na，HE Wei-zhong*
（Lishui Academy of Agricultural Sciences，Lishui 323000，China）

Using cellulase and pectase as a mean of stimulus，composite-enzymolysis assisted extraction process of polyphenols from green tea was optimized in this investigation.The effects of factors as enzyme content，solid-to-liquid ratio，enzymolysis temperature，extraction time on the extraction rates of tea polyphenols were explored through single-factor and orthogonal test.The results showed that the optimal conditions were addition of 0.3%of cellulase and pectase respectively，solid-to-liquid ratio 1∶40 g/mL，enzymolysis temperature 50℃，enzymolysis time 45 min.Under such optimum conditions，extraction rate of green tea polyphenols reached up to 21.36%which was much higher than 17.41%obtained from traditional water extraction.

composite-enzymolysis；tea polyphenols；water extraction；condition optimization

TS272.2

A

1002-0306（2016）08-0211-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.035

2015－09－08

郑生宏（1985-），男，硕士，助理研究员，研究方向：茶叶加工和茶生物化学，E-mail：zheng19851021@163.com。

*通讯作者：何卫中（1973-），男，高级农艺师，研究方向：茶叶加工技术，E-mail：Jnhwz@126.com。

现代农业产业技术体系建设专项资金资助（CARS-23）；丽水市茶叶产业科技创新团队项目（2012cxtd05）。