青藏高原牦牛酸奶中具高抗氧化能力乳酸菌的筛选

陈 明，柯文灿，保安安，张红梅，荆佩欣，张 娟，丁武蓉，*（.兰州大学生命科学学院草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730000；.兰州大学草地农业科技学院草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州73000）

青藏高原牦牛酸奶中具高抗氧化能力乳酸菌的筛选

陈 明1，柯文灿1，保安安1，张红梅2，荆佩欣1，张 娟1，丁武蓉1，*
（1.兰州大学生命科学学院草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730000；2.兰州大学草地农业科技学院草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃兰州730020）

研究了从青藏高原牦牛酸奶中分离的881株乳酸菌的H2O2耐受能力，从中筛选出了8株对H2O2具有较强耐受能力的乳酸菌，并对它们清除DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的能力以及T-AOC活性做了进一步研究。结果显示，乳酸菌对DPPH自由基的清除能力都是活细胞体高于无细胞提取物；而在对OH自由基、O2-自由基的清除和T-AOC活性上恰好相反。菌株BX62、XS40和XM5在对自由基的清除中表现突出，在菌体浓度为109CFU/mL时，BX62的活细胞体对DPPH自由基的清除率最高（33.53%），其无细胞提取物对O2-自由基的清除率同样最高（48.85%）。而在乳酸菌无细胞提取物对OH自由基的清除中XS40表现最好（52.12%）。此外，3株乳酸菌都具有较强的T-AOC活性。经16S rRNA鉴定和系统进化分析，3株菌分别为Lactobacillus parplantarum BX62，Lactobacillus plantarum XM5和Pediococcus acidilactici XS40。本研究从青藏高原牦牛酸奶中筛选的3株乳酸菌的确具有高抗氧化活性，有作为天然抗氧化剂的应用前景。

青藏高原，牦牛酸奶，自由基，乳酸菌，抗氧化能力

生物氧化作用是有机体的必要代谢过程，人体依赖这一过程获得能量，但过度的氧化作用会产生各种活性氧分子（ROS），如羟自由基（OH）、超氧阴离子（O）等。自由基作用于机体内的蛋白质、核酸等生

物大分子，造成氧化损伤，导致细胞死亡和组织损害，并引发多种疾病，给人类健康带来很大威胁［1-2］。尽管人的机体有抗氧化防御系统，但是这些系统并不能完全有效地抵御或修复氧化作用带来的损伤［3］。因此，抗氧化物的挖掘已经被保健品、化妆品等众多行业列为主要的研究方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。

乳酸菌在人体中广泛分布，是人体内正常定植菌群，是被公认为健康的微生物。目前已经有研究证明一些乳酸菌具有较好的抗氧化活性［4-7］。青藏高原牦牛酸奶作为藏区人民特色食品和生活必需品，以其丰富的营养，独特的风味和抗氧化、调节机体免疫能力等保健功能，受到了越来越多人的关注［8］。传统发酵牦牛酸奶的保健功能与其中含有大量的乳酸菌密切相关，近年来已经有大量的研究证明乳酸菌具有抑菌、增强机体免疫力、抗衰老和抗癌等益生功能。因此，无论从营养保健还是安全性方面考虑，牦牛酸奶中的乳酸菌作为天然抗氧化物质吸引了众多学者的研究兴趣，成为近年来食品研究的新兴领域。发酵乳制品是人们摄入外源乳酸菌的重要渠道，从牦牛酸奶中筛选出性能优良的、具有抗氧化活性的乳酸菌菌株，对于开发青藏高原极端环境条件下的乳酸菌种质资源，生产功能性乳制品、丰富现有乳制品种类、提高乳制品的附加值将具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌株 采样地点包括青藏高原不同海拔地区，其中涉及17个县，55个地区，覆盖青藏高原主要的牦牛集聚地区和5个主要生态地理区，分为芜湖高原湖盆寒草原区、藏东高山深谷针叶林区、藏南高山谷地灌丛草原区、果洛那曲高原山地高寒灌丛草甸区，祁连青东高山盆地针叶林、草原区，纬度跨度30°03′～37°52′，经度跨度87°13′～102°56′，海拔高度从2612～4977 m，每个地点共采集6～10户牧民牦牛酸奶，共采集了116户牧民酸奶，每户牧民牦牛酸奶样采集2份以上，共241个酸奶样品，所有采集的酸奶样品pH范围为3.65～4.87，课题组从241个酸奶样品中初步筛选得到881株乳酸菌［9］；二苯基苦基苯肼自由基 上海梯希爱化成工业发展有限公司；过氧化氢、Tris、邻苯三酚、O-菲啰啉 天津市大茂化学试剂厂；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆汁 Solarbio公司；胆盐 北京奥博星生物技术有限责任公司；以上试剂 均为分析纯；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

紫外分光光度计 日本日立公司；超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器公司；高压灭菌锅 日本三洋公司；超净工作台 名牌之星公司。

1.2 实验方法

1.2.1 具过氧化氢耐受能力乳酸菌的筛选 在灭菌的MRS液体培养基中分别添加H2O2溶液，使培养基中的起始H2O2浓度分别为1.4、1.7、2.0 mmol/L。将菌体浓度为1×108CFU/mL的乳酸菌菌液按10%的接种量接种到含不同H2O2浓度的液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养，8 h后用分光光度计测定在不同H2O2浓度下生长的乳酸菌菌液600 nm下的OD值。

1.2.2 乳酸菌细胞及无细胞提取物的制备 将活化好的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，37℃培养24 h，培养液经8000×g，10 min，4℃，离心收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整细胞浓度为1×109CFU/mL，所有菌悬液分为两组，一组作为活细胞组（IC），另一组用于无细胞提取物的制备。将乳酸菌菌体悬液冰浴超声破碎，以4℃，8000×g离心10 min，收集上清液，即为无细胞提取物（CFE）［10］。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的测定 取样品1 mL，加入浓度为0.2 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液2 mL，混匀后在室温下避光反应30 min，8000×g，4℃，离心10 min，取上清液，在517 nm下测定上清液吸光度，去离子水调零。

DPPH清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100

式中：Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度；Ac为对照组吸光度［7］。

1.2.4 羟自由基（OH·）清除能力的测定 吸取0.5 mL的样品和1 mL O-菲啰啉（浓度为0.1%），加入1 mL PBS，1 mL 2.5 mmol/L FeSO4，1 mL 20 mmol/L H2O2。37℃恒温水浴1.5 h后，536 nm下测吸光度。利用以下公式计算超氧自由基的清除率：

羟自由基清除率（%）=［（A2-A1）/（A0-A1）］×100

式中：A0为空白组吸光度；A1对照组吸光度；A2为样品组吸光度［11］。

超氧阴离子清除能力（%）=［1-A1/A0］×100

式中：A0为没有添加样品的空白对照，A1为添加样品的吸光度［12］。

1.2.6 总抗氧化能力（T-AOC）的测定 具体操作步骤严格按照南京建成总抗氧化能力试剂盒说明进行。

1.2.7 乳酸菌的16S rRNA鉴定与系统进化分析 将纯化后的乳酸菌接于MRS培养基中，37℃培养8 h后，8000 r/min离心1 min收集菌体，按照天根生化科技有限公司的试剂盒使用方法提取菌体总DNA。

在细菌的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGC TACCTTGTTAC GACTT-3’）的扩增下，进行16S rRNA序列的扩增。扩增体系（25 μL体系）为：模板0.6 μL，上下游引物各1 μL，预混酶12.5 μL，ddH2O为9.9 μL。扩增条件：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30个循环；72℃5 min。PCR产物送上海美吉生测序公司进行测序。在GenBank数据库中利用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）程序将所测定的所有菌株16S rRNA序列与该数据库中已知细菌的16S rDNA/rRNA

序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列最大同源性已知分类的菌种序列。如果两者之间的16S r RNA同源性值大于97.5%，则可认为他们属于同一个种［10］。

从数据库获得相关属种的16S rRNA基因序列，建立系统发育树。采用软件MEGA 5.5中Clustal X程序进行多重序列比对分析，通过Neighbor-Joining方法与500 Bootstrap的统计检验进行系统树的构建，以确定这几株乳酸菌的系统发育地位。

1.2.8 数据统计 用Excel 2010软件处理基础数据。采用SPSS 19.0软件的One-way ANOVE进行差异显著性检验，并用Ducan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 具H2O2耐受能力乳酸菌的筛选

通过检测881株乳酸菌在含不同浓度H2O2的MRS培养基中生长8 h后的OD值，绝大部分乳酸菌不能生长，其中有8株乳酸菌表现突出。从表1中可以看出，这8株乳酸菌的OD值随着H2O2浓度的增大都出现不同程度的下降，但下降幅度较缓。8株乳酸菌在空白培养基中培养8 h后OD值都在10以上。在H2O2浓度为1.4 mmol/L时所有菌株的OD值范围在2.291～2.437。在H2O2浓度为1.7 mmol/L时所有乳酸菌的OD值范围在1.932～2.215。在H2O2浓度为2.0 mmol/L时所有乳酸菌的OD值范围在1.885～2.156。以上数据说明这8株乳酸菌在较高的H2O2胁迫下也能正常生长，具有较强的H2O2耐受能力。

表1 各菌株在不同H2O2浓度下的OD值Table1 OD value of strains in different concentration H2O2

2.2 乳酸菌的DPPH自由基清除能力

如表2所示，8株乳酸菌的无细胞提取物和活细胞体都表现出不同程度的DPPH自由基清除能力，且乳酸菌活细胞体对DPPH自由基的清除率总高于无细胞提取物。在乳酸菌无细胞提取物对DPPH自由基的清除中，菌株MS15表现最差，清除率仅为11.94%；菌株BX62的DPPH自由基清除率最高，为29.06%，除菌株XM5外显著高于其他乳酸菌（p＜0.05）。在乳酸菌活细胞体对DPPH自由基的清除中，清除率最高的同样是菌株BX62，为33.53%，显著高于其他菌株（p＜0.05）。

2.3 乳酸菌的OH自由基清除能力

从表3中可以看出，8株乳酸菌都具有较强的OH自由基清除能力，且乳酸菌无细胞提取物的OH自由基清除率总高于活细胞体。在乳酸菌无细胞提取物对OH自由基的清除中，菌株BX62、XS40、XM5表现最好，其中菌株XS40的清除率为52.15%，显著高于其他菌株（p＜0.05）。而在乳酸菌活细胞体对OH自由基的清除中，菌株BX62、XS32、XS40、XM8的清除率都大于30%，彼此之间没有显著差异（p＞0.05）。

表2 各菌株对DPPH自由基的清除率（%）Table2 Scavenging rate of strains on DPPH radical（%）

表3 各菌株对OH自由基的清除率（%）Table3 Scavenging rate of strains on hydroxyl radical（%）

表4 各菌株对O自由基的清除率（%）Table4 Scavenging rate of strains on superoxide anion radical（%）

表4 各菌株对O自由基的清除率（%）Table4 Scavenging rate of strains on superoxide anion radical（%）

菌株 无细胞提取物 活细胞体BX62 48.85±0.33a 34.83±0.00a XS14 25.14±0.83g 23.55±0.38e XS32 31.32±1.33e 29.29±0.23d XS40 45.33±0.38b 32.85±0.38b XS53 28.38±0.12f 29.42±0.46d XM5 44.76±0.20b 31.00±0.68c XM8 38.07±0.50c 28.50±0.50d MS15 33.84±0.87d 24.34±0.34e

2.5 乳酸菌的T-AOC活性

从表5中可以看出，8株乳酸菌的无细胞提取物和活细胞体都具有一定的T-AOC活性，且乳酸菌无细胞提取物的T-AOC活性都总是高于活细胞体。在所有乳酸菌中菌株BX62具有最高的T-AOC活性，其无细胞提取物和活细胞体的T-AOC活性的分别为2.21 U/mL和1.22 U/mL，均显著高于其他乳酸菌（p＜0.05）。此外，菌株XS40和XM5的无细胞提取物和活细胞都具有较高的T-AOC活性。

表5 菌株的T-AOC活性（U/mL）Table5 The total antioxidant activity of strains（U/mL）

2.6 乳酸菌的16S rRNA鉴定与系统进化分析

将测定的乳酸菌16S rRNA基因序列在GenBank数据库中通过BLAST工具与已发表的16S rRNA基因序列进行同源性比对，寻找与目的基因序列最大同源性已知分类的菌种序列。如表6所示，经16S rRNA鉴定，8株乳酸菌分为3类菌种，包括2株类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）、5株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和1株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），相似度都在99%以上。

表6 各菌株鉴定结果Table6 Identification results of the strains

在NCBI中查找与目标菌株同源性高的菌株序列，利用MEGA 5.5，以N-J方法绘制乳酸菌的16S rRNA基因系统发育树。如图1所示，植物乳杆菌XS14、XS32、XS53、XM5、MS15与Lactobacillus plantarum WCFS1 strain WCFS1的系统发生地位最近，类植物乳杆菌BX62和XM8与Lactobacillus paraplantarum strain DSM 10667的系统发生地位最近，乳酸菌片球菌XS40 与Pediococcus acidilactici strain DSM 20284的系统发生地位最近。根据以上数据可确定菌株BX62和XM5为类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum），菌株XS14、XS32、XS53、XM5、MS15为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株XS40为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

图1 菌株的系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of the strains

3 讨论

乳酸菌清除活性氧自由基的机理，多数报道认为主要是乳酸菌可以产生清除O自由基的超氧化物歧化酶（SOD）和清除H2O2、OH自由基的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），也正是这些酶使其具有抗氧化活性［13-14］。国内外有不少关于以H2O2耐受能力作为初步筛选具抗氧化能力乳酸菌的研究，普遍采用的方法是检测乳酸菌在H2O2浓度为0.4、0.7、1.0 mmol/L的培养基中生长8 h后的存活率［15］。为了筛选出真正在较强氧化胁迫环境下也能生存的乳酸菌，本研究检测了从青藏高原牦牛酸奶中分离的881株乳酸菌在H2O2浓度高达1.4、1.7、2.0 mmol/L的培养基中生长8 h后的存活率，结果显示有8株乳酸菌表现突出，这8株乳酸菌在H2O2浓度高达2.0 mmol/L时菌液OD值都在1.8以上，具有较高的存活率。通过与其他相关研究［16-17］的实验结果对比，可知本实验初步筛选出的8株乳酸菌具有较强的H2O2耐受能力，能在较强氧化胁迫环境下生存。同时也证明在青藏高原这种极端环境条件下确实存在着对氧化胁迫具有很强耐受能力的乳酸菌菌株。

DPPH自由基的清除已经成为一种广泛使用的筛选和评价抗氧化剂抗氧化能力的方法［18］。生命活动的代谢过程所产生的自由基中，OH自由基是体内极为活泼的自由氧，氧化能力极强。因此，迫切需要加强清除OH自由基的研究［19］。虽然O自由基不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生的fenton反应产生具有具有高活性的OH自由基。本实验结果显示这8株乳酸菌的无细胞提取物和活细胞体均具有不同程度的自由基清除能力。此外，从实验结果中可以发现一定的规律：本实验初步筛选出的8株乳酸菌对DPPH自由基的清除能力都是活细胞体高于无细胞提取物；而在对HO·自由基、O自由基的清除和T-AOC活性上，除了个别乳酸菌外，都是无细胞提取物高于活细胞体。以

上结果说明不同乳酸菌对同种自由基的清除活性物质在数量上差距很大，且不同自由基的清除活性物质处于细胞中的不同位置。

目前国内外有关具抗氧化能力乳酸菌的筛选的研究不少，筛选的乳酸菌的自由基清除能力有高有低。骞宇等［20］从青藏高原牦牛酸奶中筛选出三株具高抗氧化能力乳酸菌La3、La10和La11，这3株乳酸菌浓度为1010CFU/mL的无细胞提取物对O自由基的清除最高为62.5%，对DPPH自由基的清除率最高为48.6%。Li等［21］从中国传统食物中筛选出一株具高抗氧化能力植物乳杆菌C88，在菌体浓度为1010CFU/mL 时OH自由基清除率为44.31%，DPPH自由基清除率为53.05%，但是发现当菌体浓度为109CFU/mL时，DPPH自由基清除率大幅下降。张书文等［22］从传统发酵乳制品中筛选出2株具抗氧化能力乳酸菌SY13和LJJ，在菌体浓度为109CFU/mL时DPPH自由基清除率最高为27.5%，对OH自由基和O自由基的清除率都在30%左右。本研究中，根据实验结果可知菌株BX62、XS40和XM5在对活性氧自由基的清除中显著强于其他乳酸菌菌株。在菌体浓度为109CFU/mL时，菌株BX62的活细胞体对DPPH自由基的清除率最高（33.53%），XS40和XM5的清除率也都在27%以上。在乳酸菌无细胞提取物对O自由基的清除中BX62同样最高（48.85%），XS40和XM5都在44%以上。而在乳酸菌无细胞提取物对OH自由基的清除中XS40表现最好（52.12%），BX62和XM5也都在43%以上。此外，三株乳酸菌的T-AOC活性都在1.9 U/mL以上，BX62最高（2.21 U/mL）。通过与其他研究结果对比，可发现菌株BX62、XS40和XM5确实具有较强的自由基清除能力，尤其是具有很强的OH自由基清除能力。

4 结论

从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中筛选出3株性状优良、具高抗氧化能力乳酸菌Lactobacillus paraplantarum BX62、Lactobacillus plantarum XM5和Pediococcus acidilactici XS40。本次实验采用的乳酸菌是从我国青藏高原不同海拔、不同地区采集的241份牦牛酸奶样品中分离得到的881株乳酸菌，具有纯正的地域代表性，这也是首次如此全面、大范围的从青藏高原牦牛酸奶中分离筛选功能性发酵乳酸菌。实验结果显示这3株乳酸菌对氧化胁迫具有很强的耐受能力；对活性氧自由基具有较强的清除能力，尤其是具有很强的OH自由基清除能力。在此基础上，我们准备将筛选出来的3株具高抗氧化能力乳酸菌进行下一步的体内实验。

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Screening of lactic acid bacteria with high antioxidant capacity in Tibetan Plateau yak yogurt

CHEN Ming1，KE Wen-can1，BAO An-an1，ZHANG Hong-mei2，JING Pei-xin1，ZHANG Juan1，DING Wu-rong1，*
（1.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems，college of Life Science，Lanzhou University，Lanzhou730000，China；2.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，
Lanzhou University，Lanzhou 730020，China）

The H2O2-resistant capacity of 881 strains which isolated from yak yoghurt in the Qinghai Tibet Plateau was introduced in this paper and 8 strains were screened out.It was also studied the scavenging abilities on DPPH radical，OH radical，O2-radical and total antioxidant capacity.The results showed that intact cells of lactic acid bactera scavenged the DPPH radical were more significantly than cell-free extracts while the opposite to clean up OH radical，O2-radical and total antioxidant capacity.According to the data，strains BX62，XS40 and XM5 had outstanding performance in the scavenging of free radicals.The intact cells of BX62 showed the highest ability to scavenge DPPH free radical（33.52%）at the concentration of 109CFU/mL.Besides its cell free extracts also had the best scavenging ability on O2-radical（48.85%）.While the cell-free extracts of XS40 showed the highest ability to scavenge OH radical（52.12%）.In addition，3 strains also had higher T-AOC activity.3 strains screened out in this paper were Lactobacillus parplantarum BX62，Lactobacillus plantarum XM5，and Pediococcus acidilactici XS40 by 16S rRNA identification and phylogenetic analysis.In this study，3 strains of lactic acid bacteria screened out from yak yogurt in the Qinghai Tibet Plateru really had high antioxidant activity，which would have an application prospect as a natural antioxidant in the future.

Tibetan Plateau；yak yoghurt；free radical；lactic acid bacteria；antioxidant capacity

TS252.1

A

1002-0306（2016）08-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.033

2015－09－14

陈明（1992-），男，硕士研究生，研究方向：乳酸菌种质资源的发掘，创新与利用，E-mail：chenm2014@lzu.edu.cn。

*通讯作者：丁武蓉（1982-），女，讲师，研究方向：食品微生物，E-mail：dingwr@lzu.edu.cn。

国家自然科学基金（31272486）；兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金（20220132YK13）。