两株嗜酸乳杆菌体外降解粘蛋白能力的研究

张丹青，丁秀云，李 婉，霍贵成（东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

两株嗜酸乳杆菌体外降解粘蛋白能力的研究

张丹青，丁秀云，李 婉，霍贵成*
（东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

以从人体肠道中筛选，并经16S rDNA鉴定的2株嗜酸乳杆菌KLDS1.0901、KLDS1.0902为研究对象，体外评估两株嗜酸乳杆菌降解粘蛋白的能力。体外粘蛋白降解能力的评估主要是通过液体培养法、SDS-PAGE蛋白分析以及平板降解实验三部分进行。受试菌株在含粘蛋白的液体培养基中生长不良，粪便菌群生长良好；SDS-PAGE粘蛋白残留分析检测以及平板粘蛋白溶圈检测表明受试菌株无粘蛋白降解活性，而粪便菌群产生阳性反应。实验结果表明，两株嗜酸乳杆菌无体外降解粘蛋白活性。

嗜酸乳杆菌，粘蛋白降解，安全性

人类胃肠道表面覆盖着一层保护性粘液，粘液主要由水（95%）、高分子量的粘蛋白（5%）以及极少量的电解质、脂质等构成［1-2］。粘液层在粘膜屏障系统中发挥重要作用，能够保护胃肠道内壁免受病原体、毒素以及机械性的损伤［3］。据报道，粘液可以作为细菌生长的养分来源，因此，细菌能够生存、繁殖、定植于黏液层是其可以耐受胃肠道环境的重要优势［4］。

乳酸菌具有调整肠道微生物菌群平衡、缓解乳糖不耐受、降低胆固醇水平、抑制肠道不良微生物增殖等功能。然而，Ruas-Madiedo［5］研究发现一些两岐双岐杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌菌株具有粘蛋白降解活性并且存在具有编码与粘蛋白降解相关的酶的基因。Ruseler-van等［6］认为消除粘液层可能会增加粘附在胃肠表面细菌的数量，也可能促进正常的肠道细菌转移到其他肠道组织中，甚至导致一些致病菌转移到其他组织。因此，粘蛋白降解活性被认为是肠腔内细菌是否具有潜在致病性和毒性的一个重要指标，而粘蛋白降解实验应当被推荐为益生菌菌株安全性评估的一项内容［7］。本文对两株益生嗜酸乳杆菌体外降解粘蛋白的能力进行测定，以进一步评估其潜在致病性及毒性，为乳酸菌安全性评价方面的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜酸乳杆菌KLDS1.0901、KLDS1.0902 均来自乳品科学教育部重点实验室；粪便菌群 取自健康

成年男性的新鲜粪便（F），灭菌后的粪便菌群（HF）；蛋白胨、牛肉膏 北京奥博星公司；酵母粉、胰蛋白胨 OXOID公司；琼脂粉 Solarbio公司；硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸氢二铵、乙酸钠 天津市风船化学试剂科技有限公司；葡萄糖、Tween-80、磷酸氢二钾、葡萄糖 国药集团化学试剂有限公司；BHI肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司；胃粘蛋白、氨基黑10B 上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（TRIS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、β-巯基乙醇、过硫酸铵、溴酚蓝 Biotopped公司。

DELTA 320pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；HVE-50全自动高压灭菌锅 日本日立；SectrumLab54紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司；DHP-9272电热恒温培养箱 上海-恒科技有限公司；VD-1320洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；Mini Protean 3 Cell小型垂直电泳仪BIO-RAD（伯乐）中国公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胃粘蛋白纯化 在Miller等［8］对粘蛋白纯化方法的基础上进行改进。称取10 g胃粘蛋白于500 mL 含0.02 mol/L磷酸盐缓冲液和几滴甲苯的0.1 mol/L氯化钠溶液中，室温下搅拌24 h。1 h后用2 mol/L氢氧化钠调节悬液的pH为7.2。10000 r/min、4℃离心后，取上清液冷却至（0±2）℃，添加冰乙醇至终浓度为60%（v/v）。将得到的沉淀溶解于0.1 mol/L氯化钠溶液中，再用冰乙醇沉淀两次。粘蛋白沉淀颗粒用乙醇洗涤一次，然后溶解于4 L蒸馏水中并过滤，渗出液冻干后备用。

1.2.2 培养基配制 基础培养基（B）、含0.3%胃粘蛋白的基础培养基（B+M）、添加1%葡萄糖的基础培养基（B+G）以及含有0.3%胃粘蛋白和1%葡萄糖的基础培养基（B+M+G）的配制参见文献［9］。

1.2.3 菌种活化 KLDS 1.0901和KLDS 1.0902在MRS固体培养基上划线，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养24 h。F和HF则在BHI液体培养基中37℃厌氧培养24 h。

1.2.4 粘蛋白降解—液体培养实验 取24 h培养物，分别以1%的量接种至B、B+M、B+G以及B+M+G，37℃培养48 h。测定培养液pH以及600 nm处的吸光度，每个样品做三组平行，测定结果以平均值±标准差的形式表示。

1.2.5 SDS-PAGE粘蛋白残留实验

1.2.5.1 电泳样品的制备 1.2.4中得到的B+M培养物用于粘蛋白残留分析。取48 h培养液10 mL，

10000 r/min、4℃离心30 min，吸取上清至干净离心管中，加入15 mL 99%的冰乙醇（冷冻的），10000 r/min 4℃离心30 min，弃去上清，得到的沉淀用6 mL 0.1 mol/L的NaCl溶液溶解。再加入15 mL 99%的冰乙醇，10000 r/min、4℃离心30 min，得沉淀，用0.5 mL 的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，得到蛋白质样品；将蛋白质样品与等体积的2×SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液直接混合，电泳前沸水浴3～5 min，再置于冰浴3 min。

1.2.5.2 SDS-PAGE凝胶电泳 分别配制浓度为12.5%的分离胶以及浓度为5%的浓缩胶；上样量为10 μL；电泳时，浓缩胶电压为80 V，30 min；分离胶电压为120 V，1 h。

1.2.5.3 固定 用异丙醇、乙酸、水（体积比为5∶2∶9）配制而成的固定液固定8 h。

1.2.5.4 染色 取0.75 g考马斯亮蓝R-250于500 mL脱色液，过滤，染色2～3 h。

1.2.5.5 脱色 用甲醇、乙酸、水（体积比为227∶37∶236）配制成的脱色液进行脱色至蛋白质区带清晰，观察蛋白质变化情况。

1.2.6 粘蛋白降解平板实验 取10 μL 24 h的细菌培养物分别接种至固体培养基表面（B+M、B+M+G），37℃厌氧培养72 h后，用含0.1%氨基黑10B的3.5 mol/L的醋酸染色30 min，之后用1.2 mol/L的醋酸洗净，观察接种区域周围的变化情况。

2 结果与讨论

2.1 受试菌株在液体培养基的生长状况

表1分别列出了KLDS1.0901、KLDS1.0902、F及HF在四种培养基中培养48 h后测得的OD600 nm和pH，反应出实验菌株在相应培养基中的生长状况。

从表1中可以看出，HF在四种培养基中的两项指标基本无变化，说明无细菌生长。两株嗜酸乳杆菌在B+G、B+M+G中的OD600 nm明显高于B以及B+M，而F则在四种培养基中均表现较高的OD600 nm。此外，嗜酸乳杆菌在含B+M中的OD600 nm与B并无明显差异。培养基pH的变化在一定程度上与OD600 nm的变化趋势呈负相关，受试菌株在B和B+M中的pH基本无差异，且高于B+G以及B+M+G。两株嗜酸乳杆菌在相同培养基中的OD600 nm和pH相近。

2.2 SDS-PAGE粘蛋白残留实验

SDS-PAGE法测定培养基中粘蛋白残留结果如图1所示，考马斯亮蓝染色用于分析蛋白残留［10］。由图1可以观察到，在考马斯亮蓝染色方法下，F样品残留物有不同大小的片段出现，可以判定粘蛋白分子

被降解，即F粘蛋白降解阳性，而两株嗜酸乳杆菌以及HF样品均无降解片段出现，即粘蛋白降解阴性。在此项测试中，与F相比，两株嗜酸乳杆菌均无粘蛋白降解活性。

表1 受试菌株48 h培养后的OD600 nm和pHTable1 The OD600 nmand pH of testing strains cultivated over 48 h

图1 SDS-PAGE分析菌液中粘蛋白残留Fig.1 SDS-PAGE analysis of mucin residues in basal medium with mucin cultures incubated with bacterial strains

2.3 粘蛋白降解平板实验分析

菌落周围出现溶解圈则表明该菌具有粘蛋白降解活性。受试菌株粘蛋白降解平板实验的结果如图2所示，在B+M中，F生长良好，形成较大菌落，且菌落周围出现透明的溶解圈；HF不形成菌落且无溶解圈出现；菌株KLDS1.0901、KLDS1.0902生长不良且无溶解圈（图2a）。在B+M+G中，F生长良好，形成较大菌落但周围未出现溶解圈，这是由于在有葡萄糖存在的条件下，F优先利用葡萄糖；菌株KLDS1.0901、KLDS1.0902的生长状况优于不添加葡萄糖的培养基，形成清晰的菌落但周围无溶解圈出现（图2b），这是由于乳酸菌可以利用葡萄糖进行代谢活动。

图2 受试菌株平板粘蛋白降解图Fig.2 Mucin degradation assay in agarose petri dish

3 结论

本研究通过三项测试评估了两株嗜酸乳杆菌KLDS1.0901、KLDS1.0902的体外粘蛋白降解活性，结果发现该2株菌在体外环境下不能降解粘蛋白，但在胃肠道环境下是否具有粘蛋白降解活性还需要进一步的研究。

本研究结果与Zhou JS［11］，Fernández M F［9］，Fumiaki等［12］对嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、动物双歧杆菌亚种的研究结果一致。这些研究结果表明，许多益生双歧杆菌和乳酸菌可能没有降解粘蛋白的能力。尽管双歧杆菌属的大多数长双歧杆菌以及假小链双歧杆菌没有粘蛋白降解活性，研究者们发现一些两岐双岐杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌菌株不仅具有粘蛋白降解活性并且具有编码与粘蛋白降解相关的酶的基因［5，13］。鉴于前人的研究成果，有必要将粘蛋白降解活性的评估纳入为益生菌安全性评价的内容之一。

［1］Bansil R，Turner B S.Mucin structure，aggregation，physiological functions and biomedical applications［J］.Current Opinion in Colloid&Interface Science，2006，11（2-3）：164-170.

［2］李松华，连超.胃粘液的理化性状研究进展［J］.国外医学（消化系疾病分册），2002（1）：4-6.

［3］Strous G J，Dekker J.Mucin-Type Glycoproteins［J］.Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，1992，27（1-2）：57-92.

［4］Derrien M，Vaughan E E，Plugge C M，et al.Akkermansia muciniphila gen.nov.，sp.nov.，a human intestinal mucin-degrading bacterium［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54（5）：1469-1476.

［5］Ruas-Madiedo P，Gueimonde M，Fernández-García M，et al.Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（6）：1936-1940.

［6］Ruseler-van Embden J，Van der Helm R，Van Lieshout L.Degradation of intestinal glycoproteins by Bacteroides vulgatus ［J］.FEMS Microbiology Letters，1989，58（1）：37-41.

［7］刘勇，张勇，张和平.世界益生菌安全性评价方法［J］.中国食品学报，2011（6）：141-151.

［8］Miller R S，Hoskins L C.Mucin degradation in human colon ecosystems［J］.Gastroenterology，1981，81（4）：759-765.

［9］Fernández M F，Boris S，Barbés C.Safety evaluation of Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis UO 004，a probiotic bacterium［J］.Research in Microbiology，2005，156（2）：154-160.

［10］王孝平，邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究［J］.天津化工，2009（3）：40-42.

［11］Zhou J S，Gopal P K，Gill H S.Potential probiotic lactic acid bacteria Lactobacillus rhamnosus（HN001），Lactobacillus acidophilus（HN017）and Bifidobacterium lactis（HN019）do not degrade gastric mucin in vitro［J］.International Journal of Food Microbiology，2001，63（1）：81-90.

［12］Abe F，Muto M，Yaeshima T，et al.Safety evaluation of probiotic bifidobacteria by analysis of mucin degradation activity and translocation ability［J］.Anaerobe，2010，16（2）：131-136.

［13］Hoskins L C.Mucin degradation in the human gastrointestinal tract and its significance to enteric microbial ecology［J］.European Journal of Gastroenterology&Hepatology，1993，5（4）：205-213.

Study on mucin degradation activity of two strains of Lactobacillus acidophilus in vitro

ZHANG Dan-qing，DING Xiu-yun，LI Wan，HUO Gui-cheng*
（Northeast Agriculture University，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Harbin 150030，China）

In this study，the ability to degrade mucin of two strains of Lactobacillus acidophilus（KLDS1.0901 and KLDS1.0902）screened from the human intestine and identified by 16S rDNA in vitro was evaluated.Mucinolytic activity was examined using the following three tests：growth in liquid medium，SDS-PAGE analysis of degraded mucin residues，and degradation assay in Petri dish.The test strains fell to grow in the liquid medium containing mucin，while fecal sample grew well.In the SDS-PAGE analyses of mucin residues and observation of mucinolytic zone in agar plate，the two test strains also showed no mucin degradation activity，while fecal sample yielded positive results.The results demonstrated that strains tested were unable to degrade gastrointestinal mucin in vitro.

Lactobacillus acidophilus；mucin degradation；safety

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0155-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.023

2015－10－08

张丹青（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：a10090119@163.com。

*通讯作者：霍贵成（1958-），男，博士，教授，研究方向：食品微生物与生物技术，E-mail：gchuo58@126.com。

国家863项目（2011AA100902）。