60Co辐照对卵清蛋白结构和抗氧化性的影响

涂宗财，谢 欢，钮培佩，王 辉，马 达（.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.江西师范大学生命科学学院，江西南昌330022）

60Co辐照对卵清蛋白结构和抗氧化性的影响

涂宗财1，2，谢 欢1，钮培佩1，王 辉1，马 达1
（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.江西师范大学生命科学学院，江西南昌330022）

采用6种钴60辐照剂量（0、2、4、6、8、10 kGy）处理鸡蛋卵清蛋白（OVA），并探明辐照技术对卵清蛋白结构和抗氧化性的影响。以新鲜鸡蛋为原料，经0、2、4、6、8、10 kGy 6种钴60辐照剂量处理；硫酸铵沉淀法提取卵清蛋白；并测定不同辐照条件下卵清蛋白溶解度、自由巯基含量、内源性荧光、还原力、DPPH自由基清除率的变化。实验结果表明：辐照对于卵清蛋白的结构和理化性质影响较大，随着辐照剂量的增加，OVA的可溶性蛋白含量、自由巯基含量、DPPH清除能力和还原力，均有不同程度的提高；内源荧光呈现先上升后下降趋势，当辐照剂量为10 kGy时，内源荧光值显著低于对照组（p＜0.05）。此研究为辐照卵清蛋白产品的工业应用提供了理论依据。

卵清蛋白，辐照，结构，抗氧化性

鸡蛋卵清蛋白（ovalbumin，OVA）是一种优质蛋白，占鸡蛋中蛋清总蛋白的54%～69%，分子量45000 u，等电点pH4.5，是鸡蛋的主要成分［1］。因卵清蛋白具有良好的营养价值和乳化性、起泡性，可以被添加于鱼糜、方便面、糕点等多种食品中。随着人们对于速食食品的方便即食和货架期长等方面要求的不断提高，辐照、真空包装、防腐剂、冷藏等技术手段被应用在食品加工和食品储藏中，尤其是辐照保藏技术，因其具备降低食品病原体污染和保留食品完好风味的双重优点而广受青睐，已逐渐成为重要的保藏手段之一［2］。

OVA的热凝固点低，稍微加热处理，蛋白便会变性［3］。而辐照是一种有效控制食品中病原微生物，延长食品货架期的方法［4］。它是一种典型的“冷处理”物理方法，几乎不会引起食物内部温度改变，从而最大程度还原食物原有风味［5］。同时，辐照还具有耗能少，运行成本低等优点。联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）、世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和国际原子能机构（International Atomic Energy Agency，IAEA）辐照食品联合专家委员会早在1980年10月制

定了国际安全线，即任何食品总体平均吸收剂量不超过10 kGy时，不存在毒理学的危险，也不会产生特别的微生物学和营养的问题［6］。已有研究表明：花生蛋白经1 kGy以上辐照处理后，分子量大于96.9 ku蛋白含量增加［7］；红豆蛋白通过辐照处理后，溶解性得到了明显改善，当辐照剂量达到5 kGy时，溶解度达到最高；但随着辐照剂量的进一步增加，其溶解度有下降趋势［8］。大豆蛋白经低剂量处理后持水性、持油性、分散性和粘度等都没有明显变化，仍然保留其原有较好的功能性［9］。目前关于辐照对卵清蛋白处理结构性质影响的研究报道较少。

本实验主要采用6种钴60辐照剂量（0、2、4、6、8、10 kGy）处理鸡蛋，处理后的蛋清提取OVA，并测定OVA的自由巯基含量、内源荧光、溶解性、表面疏水性和抗氧化性等功能性质，拟探讨辐照技术对鸡蛋主要功能蛋白（卵清蛋白）结构和性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋 购买自江西南昌天虹超市江大店；硫酸铵、乙二胺四乙酸（ethylenediaminete traacetic acid，EDTA） 购买自天津市大茂化学试剂厂；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、去离子甲酰胺 购于北京索莱宝科技有限公司；硫酸铵、5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）［（5，5’-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB］、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（glycine）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、K3Fe（CN）6、三氯乙酸（TCA） 购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

F-7000型荧光光度计 日本日立公司；T6型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器责任有限公司；Nicop380 ZLS型激光纳米粒度测定仪 美国PSS（Particle Sizing Systems）公司；LGJ-1型冷冻干燥机 北京亚泰科隆仪器技术有限公司；TGL-10C高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 卵清蛋白的提取 以鲜鸡蛋为原料，采用盐析法分离提纯卵清蛋白，冷冻干燥后备用。

卵清蛋白制备工艺：蛋清→过滤→蒸馏水稀释并调pH5.5→4000 r/min离心→上清液添加硫酸铵至饱和度50%→4000 r/min离心→上清液调pH4.5→沉淀用10-4mol/L EDTA溶解→添加硫酸铵至饱和度38%→4000 r/min离心→重复上述步骤直至6次重结晶→透析24 h→冻干［10］。

1.2.2 样品处理 分别将5%卵清蛋白溶液冻干成粉末，送去江西科苑辐照有限公司进行60Coγ辐照处理，剂量为2、4、6、8、10 kGy共5个剂量的辐照处理，未经辐照的做为对照组。

1.2.3 可溶性蛋白含量的测定［11］双缩脲试剂的配制：0.75 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和3g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用250 mL蒸馏水溶解，在搅拌下加入150 mL 10%NaOH，用水稀释到500 mL。

标准曲线的绘制：于试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL浓度为10 mg/mL的牛血清蛋白（BSA）溶液，用蒸馏水补足到1 mL，然后加入4 mL双缩脲试剂。用漩涡混合器充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30 min，与540 nm处进行比色测定。空白对照以蒸馏水代替BSA溶液。取三组测定的平均值，以蛋白质的mg数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，y=5.6603x+0.0122（R2=0.9965）。

可溶性蛋白含量的测定：1 mL样品溶液加入4 mL双缩脲试剂；1 mL样品溶液试剂和4 mL双缩脲试剂做空白调零，室温反应30 min，540 nm处测其吸光值，根据标准曲线求出样品蛋白浓度。将经过处理的蛋白溶液于10000 r/min转速离心10 min，使不溶物沉淀，取上清液以双缩脲法测定其可溶性蛋白质含量。

1.2.4 自由巯基的测定 蛋白质中自由巯基含量的变化是通过Ellman［12］的方法来测定的。

Ellman试剂配制：4 mg DTNB溶解于l mL Trisglycine緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Glycine，和0.004 mol/L EDTA，pH8.0）。

样品测量：4 mL卵清蛋白溶液（1 mg/mL，溶剂为含有8 mol/L尿素的Tris-glycine缓冲液）与200 μL Ellman试剂混合，室温下放置30 min后经8000 r/min离心20 min，用Tris-glycine缓冲液作为空白，在412 nm处测量吸光度值。

自由巯基含量的计算公式如下［13］：

式中：摩尔消光系数=13600 mol/（L·cm）。

1.2.5 荧光光谱的分析 用F-7000荧光光谱仪测定不同辐照剂量对OVA荧光强度的影响，取OVA配制成0.2 mg/mL的溶液，取2 mL放置于1 cm×1 cm的四面透比色皿中，在激发波长为280 nm，扫描发射波长范围300～500 nm，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm［14］。

1.2.6 DPPH自由基清除率的测定 配制一系列浓度的样品溶液，将3 mL的样液与1 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L，溶于无水乙醇）混匀后，在室温下避光反应30 min，在517 nm下测吸光值As，对照组为1 mL DPPH溶液加上3 mL去离子水代替样品在517 nm下测定其吸光值A0，采用VC作对照［15］，计算如下：

式中：A0—对照组吸光值；As—样品组吸光值。

1.2.7 还原力的测定 取一定浓度的样品液2 mL加入2 mL磷酸缓冲液（pH6.6，0.2 mol/L）和2 mL 1%的K3Fe（CN）6溶液中，于50℃水浴中反应20 min后迅速冷却，加入2 mL 10%（w/v）的三氯乙酸（TCA）溶液，充分混匀后，以8000 r/min离心5 min，取上清液2 mL，并加入蒸馏水2 mL及400 μL 0.l%（w/v）的FeCl3溶液，混匀后于50℃水浴中反应10 min，在波长700 nm处测吸光值，吸光值越大，说明样品的还原力越强，抗氧化能力越强［16］。

1.2.8 统计分析 本实验均进行3次平行实验，2次重复实验。采用Origin 8.6软件作图，SPSS 19.0软件统计分析；p＜0.05表示具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 辐照处理对卵清蛋白可溶性蛋白含量的影响

由图1可知，经辐照处理组OVA的可溶性蛋白含

量相对于未处理组均有增加，随着辐照剂量的增加，可溶性蛋白含量呈现上升的趋势，卵清蛋白的可溶性蛋白含量得到明显改善（p＜0.05）。当辐照剂量达到10 kGy时样品OVA的可溶性蛋白含量达到最大。辐照处理能够导致自由巯基含量显著上升，蛋白质分子发生去折叠，亲水性基团暴露，从而体现在可溶性蛋白含量的提高［17］。石燕等［18］研究随着辐照剂量从2～10 kGy，可溶性蛋白含量先上升后下降，随着辐照剂量的上升，肌原纤维蛋白呈现一种先折叠包埋疏水性氨基酸残基，高辐照剂量时，肌原纤维蛋白的发生去折叠，从而暴露了疏水性氨基酸残基。而每种蛋白质结构和性质都有差距，对于辐照的耐受能力也存在着差异。

图1 辐照对卵清蛋白可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effect of radiation on solubility of OVA

2.2 辐照对卵清蛋白自由巯基的影响

如图2所示，巯基含量经过辐照处理后显著上升，辐照0～8 kGy随着辐照剂量的增加，巯基含量显著上升，8～10 kGy剂量没有显著性差异，巯基含量的升高意味着OVA的二级、三级结构受到破坏［19］。其可能的原因是辐照使蛋白分子结构展开，使埋藏分子内部的巯基和疏水基团暴露［17］，还有可能与蛋白质部分二硫键断裂，生成了游离的巯基，从而使得经辐照处理之后的OVA自由巯基的含量升高［20］。

图2 辐照对卵清蛋白自由巯基的影响Fig.2 Effect of radiation on free sulfhydryl contents of OVA

巯基基团在天然蛋白质中难以取代，而且起着很重要的作用。巯基基团与蛋白质聚集体的产生和热处理后凝胶结构有关。卵清蛋白中的巯基基团藏于天然蛋白分子的疏水核心。研究发现，巯基-二硫键之间的转换是影响蛋白质功能性质的重要因素［21］。

2.3 荧光光谱法分析辐照对卵清蛋白影响

图3是经过6种辐照剂量处理OVA内源荧光发射波谱，它的最强吸收峰的发射波长为345 nm左右，没有显著出现明显红移或蓝移。图3中的最大荧光强度作为纵坐标，辐照剂量作为横坐标绘制成图4，由图4可知随着辐照剂量的增加，最大荧光强度0～2 kGy呈现上升，2～6 kGy没有显著性差异，6～10 kGy下降，且10 kGy辐照剂量下的内源荧光最大值明显小于（p＜0.05）对照组0 kGy。经过辐照处理后，OVA的内源荧光呈现先增加后降低趋势。含有芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）残基的蛋白质在280 nm或295 nm的激发光的激发下会产生荧光，这种荧光称为内源性荧光，而蛋白质中内源荧光主要来源于色氨酸残基（Trp），它对微环境的变化很敏感。内源荧光的结果表明OVA的三级结构发生改变。芳香族氨基酸周围的局部微环境发生改变是直接导致内源荧光变化的原因［22］，结合图4可知，0～8 kGy剂量下芳香族氨基酸更多的暴露在极性环境，使得其内源荧光强度上升，OVA呈现一种去折叠结构，而8～10 kGy剂量，暴露于蛋白表面的芳香族氨基酸残基被掩埋到分子内部，蛋白质呈现一种折叠结构，使其内源荧光强度显著低于（p＜0.05）对照组。

图3 辐照对卵清蛋白内源荧光的影响Fig.3 Effect of radiation on intrinsic fluorescence of OVA

图4 辐照对于内源荧光最大发射波长的影响Fig.4 Effect of radiation on max emission wavelength of intrinsic fluorescence

2.4 辐照处理对卵清蛋白DPPH自由基清除率的影响

当遇到自由基清除剂时，自由基的孤对电子被配对，反应体系在517 nm处的吸光值降低，通过测定

吸光度的变化来评价对其抗氧化性。由图5可知，经过辐照处理的卵清蛋白，随着辐照剂量的增加，DPPH自由基清除率总体呈现显著上升（p＜0.05）趋势，具体表现为：在0～8 kGy时DPPH自由基清除率，逐渐上升，8～10 kGy没有显著性变化，8 kGy时达到最大。这可能是由于通过辐照处理，蛋白质展开，自由巯基的含量上升DPPH更易接触并捕获自由基，从而清除自由基的能力增强［23］。

图5 辐照处理对卵清蛋白DPPH清除率的影响Fig.5 Effect of radiation on scavenging effects of DPPH radicals

2.5 辐照处理对卵清蛋白还原力的影响

还原力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，可以通过提供电子使自由基变为稳定的物质，以中断自由基的连锁反应［24］。物质的吸光值与还原力呈正相关，可检验待测物是否为良好的电子供体。由图6可知，经辐照处理后的卵清蛋白，随着处理剂量的增加，样品的还原力逐渐升高，10 kGy还原力达最大。这和DPPH自由基清除能力的结果是一致的，这可能是由于经过辐照处理后，溶液中自由巯基含量上升，再者蛋白质的溶解性上升导致溶液中的电子供体增加，使得还原力呈现上升的趋势。

图6 辐照处理对卵清蛋白还原力的影响Fig.6 Effect of radiation on reducing power of OVA

3 结论

本研究表明，辐照对于鸡蛋卵清蛋白的结构和理化性质影响较大，随着辐照剂量（0、2、4、6、8、10 kGy）的增加，OVA的可溶性蛋白含量、自由巯基含量、DPPH自由基清除能力和还原力，均有不同程度的提高；内源荧光呈现先上升后下降趋势，当辐照剂量为10 kGy时，内源荧光值低于对照组。推测经一定辐照处理之后OVA呈现一种去折叠结构，亲水性氨基酸残基和自由巯基暴露，自由巯基含量上升，溶解性增加，内源荧光上升，当10 kGy时，蛋白渐渐折叠，内源荧光淬灭；在蛋白质去折叠和折叠的过程中，还原性自由基暴露，从而使得其DPPH自由基清除能力和还原力上升。

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Effect of60Co radiation on structure and antioxidant activity of ovalbumin

TU Zong-cai1，2，XIE Huan1，NIU Pei-pei1，WANG Hui1，MA Da1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.College of Life Science，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China）

By studying changes on ovalbumin（OVA）from eggs treated by radiation，the effect of radiation on structure and antioxidant activity of OVA were measured.The OVA were treated by 6 radiation doses 0，2，4，6，8，and 10 kGy，respectively.Ovalbumin extracted from fresh eggs with the method of ammonium sulfate precipitation.Solubility，free sulfhydryl conten，fluorescence spectroscopy，reducing power and DPPH radical scavenging of the OVA were determined.The results showed that with the increase of radiation intensity，free sulfhydryl contents，protein solubility，reducing power and DPPH increased.However，intrinsic fluorescence firstly increased and then decreased.When the irradiation does increased to 10 kGy，intrinsic fluorescence was significantly lower than the control group.This study could provide the theoretical basis for radiated ovalbumin industrial applications.

ovalbumin；radiation；structure；antixoidant activity

TS253.1

A

1002-0306（2016）08-0135-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.019

2015-10-08

涂宗财（1965-），男，博士，教授，研究方向：食物资源开发与高效利用，E-mail：tuzc_mail@aliyun.com。

国家高技术研究发展计划（863计划）（2011AA100803）；江西省现代农业产业技术体系建设专项资金资助（JXARS-04）；江西省重大生态安全问题监控协同创新中心资助项目（JSX-EW-00）。