HPLC法同时测定南大青叶中5种有效成分的含量

张先达，陈奕龙，张丹雁（.深圳市宝安区中心医院，广东 深圳 580；.广州中医药大学 中药学院，广东 广州50006）

HPLC法同时测定南大青叶中5种有效成分的含量

张先达1，陈奕龙2，张丹雁2
（1.深圳市宝安区中心医院，广东 深圳 518102；2.广州中医药大学 中药学院，广东 广州510006）

目的建立同时测定南大青叶中5种有效成分的高效液相色谱（HPLC）法。方法采用ZORBAX Extend-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为225 nm，柱温为30℃。结果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉红进样量分别在10.86～217.2、16.21～324.2、11.34～226.8、29.85～597.0、160.5～3 210 ng范围内线性关系良好，加样回收率为98.5%～100.9%，方法学考察结果良好。结论建立的HPLC法简便快速、重复性好、结果准确可靠，可作为南大青叶药材质量标准控制的方法。

南大青叶；HPLC法；有效成分；含量测定

南大青叶为爵床科植物马蓝 Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.的干燥叶或叶及幼嫩茎，苦、咸、大寒，具有清热解毒、凉血定惊等功效［1］，主要分布于我国华南、西南和华东等地区，为抗病毒常用中草药，具有悠久的临床药用历史，但尚未列入地方及国家药品标准［2］。研究表明南大青叶化学成分以生物碱类为主，还有黄酮类、蒽醌类、三萜类、甾醇类及氨基酸等，活性成分主要为生物碱类化合物［3］。前期研究表明南大青叶中抗病毒有效成分为2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮［4］、色胺酮及靛玉红［5］等，但目前尚未有研究对这些有效成分同时进行测定，以快速评价南大青叶质量优劣。因此本试验采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定南大青叶中的5种有效成分，为完善南大青叶质量标准奠定基础。

1　仪器与试药

美国戴安SUMMIT P680高效液相色谱仪（包括SUMMIT P680低压四元泵、ASI-100自动进样器、CHROMELEONTM数据处理软件系统），UVD170U紫外检测器，SENCO R系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司），MX5精密天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA 1004N电子天平（上海菁海仪器有限公司），CX-500A型高速多功能粉碎机（上海市晟喜制药机械有限公司）。

流动相用甲醇为色谱纯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙腈为色谱纯（美国默克公司）；二氯甲烷为分析纯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为重蒸蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

2，4（1H，3H）-喹唑二酮（百灵威科技有限公司，批号LD90M21）；4（3H）-喹唑酮［韶远化学科技（上海）有限公司，批号 E021-093-42A］；2-甲基-4 （3H）-喹唑啉酮（天津希恩思生化科技有限公司，批号M-88830）；色胺酮［韶远化学科技（上海）有限公司，批号E-187-296-28C］；靛玉红（中国食品药品检定研究院，批号110717-200204）。

南大青叶采自广东、广西、福建等地，样品批号及情况详见表1。以上样品经广州中医药大学中药鉴定教研室张丹雁教授鉴定，为爵床科马蓝Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.的干燥叶及幼嫩茎。

2　方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备

分别精密称取2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉红对照品适量，置于20 mL容量瓶中，加甲醇-二氯甲烷（体积比80∶20）溶解并制成每1 mL含2，4（1H，3H）-喹唑二酮10.86 μg、4（3H）-喹唑酮16.21 μg、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮11.34 μg、色胺酮29.85 μg、靛玉红160.5 μg的混合对照品溶液。

表1　30批南大青叶的批号、来源信息表Table 1 Sample numbers and sources of 10 batches of leaves of B.cusia

2.2供试品溶液的制备

取南大青叶粉末（过3号筛）1.0 g，置于索氏提取器中，精密称定，加二氯甲烷120 mL提取至无色，回收提取液蒸干溶媒，残渣用甲醇-二氯甲烷（体积比80∶20）分次溶解并定容至25 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3色谱条件

色谱柱:ZORBAX Extend-C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相:乙腈（A）-水（B）梯度洗脱，程序为0～20 min，8%A→20%A；20～25 min，20%A →40%A，保持5 min；30～55 min，40%A→90%A，保持10 min。流速:1 mL/min；检测波长:225 nm；柱温:30℃；进样量:10 μL。分别精密吸取混合对照品、供试品溶液10 μL，按上述色谱条件测定，结果见图1。5种成分与相邻成分的分离度均大于1.5，理论塔板数不低于4 000。

图1　混合对照品（A）、南大青叶供试品（B）溶液的高效液相色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of the control（A）and test sample（B）

2.4方法学考察

2.4.1线性关系的考察 分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，分别按“2.3”项下条件测定峰面积，以对照品进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果见表2。

2.4.2精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，按“2.3”项下色谱条件测定，记录各成分峰面积。结果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉红峰面积的RSD值分别为1.6%、1.7%、1.9%、1.2%、1.1%，表明仪器精密度良好。

2.4.3稳定性试验 取同一供试品溶液（批号: N1），分别于0、1、4、8、12、24 h时各进样1次，按“2.3”项下色谱条件测定并记录峰面积。结果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4 （3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉红峰面积的RSD值分别为1.2%、1.9%、1.2%、1.3%、1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4重复性试验 取同一批（批号:N1）南大青叶粉末6份，每份2.0 g，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定并记录峰面积。结果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉红峰面积的 RSD值分别为1.4%、1.1%、1.3%、1.1%、1.2%，表明方法重复性良好。

2.4.5加样回收率试验 取已知质量分数［2，4 （1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4 （3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉红质量分数分别为31.77、48.86、16.39、85.38、340.2 μg/g］的南大青叶粉末0.8 g，共6份，精密称定，分别精密加入“2.1”项下混合对照品溶液5.00 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法测定，计算加样回收率及平均加样回收率，5种有效成分的加样回收率在95%～105%之间，结果见表3。

2.4.6样品的测定 分别取表1中30批南大青叶样品各1.0 g，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，每份南大青叶样品平行检测3次，见表4。

从表4可以看出，30批样品之间同一成分质量分数差异较大:N13与N19批次的2，4（1H，3H）-喹唑二酮质量分数相差达9倍；而同一产地之间不同批次样品同一成分的质量分数大多相对较为接近。其中，2，4（1H，3H）-喹唑二酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮及靛玉红质量分数均以广州地区所产较高，4（3H）-喹唑酮质量分数则以福建仙游地区所产为高。

表2　南大青叶中5种成分的线性关系考察结果Table 2 The linear relationship results of 5 components in leaves of B.cusia

表3　南大青叶中5种有效成分的加样回收率试验结果Table 3 Recovery results of 5 effective components from leaves of B.cusia（n=6）

3　讨论

3.1供试品溶液提取溶剂的选择

南大青叶化学成分主要以生物碱类为主，此外还有蒽醌类、黄酮类、三萜类、甾醇类及氨基酸等非生物碱类成分。现代药学研究表明，南大青叶中的活性成分主要为生物碱类化学成分，且有活性的几种生物碱类成分从化学结构上看极性相对较小［9］。本试验对比了三氯甲烷与二氯甲烷的提取效果，发现2种溶剂提取效果基本相同，考虑到三氯甲烷毒性较大，因而选择二氯甲烷作为提取溶剂。

3.2测定指标的选择

2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉红及靛蓝均为南大青叶中所含的生物碱类成分，且经研究证实具有一定的药理活性，在南大青叶药材中的质量分数相对较高且稳定，因此被选为测定指标［6-8］。

本试验采用HPLC法，以线性梯度洗脱方式进行洗脱，研究了不同批次南大青叶药材的HPLC色谱图。按本法测定所得30批南大青叶样品图谱的特征性和专属性均很强、共有峰的稳定性良好、精密度及重复性均良好，符合实验要求，可用于南大青叶药材中2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮和靛玉红5种化学成分质量分数的同时测定。

表4　30批南大青叶中5种指标成分的质量分数Table 4 Contents of 5 index components in 30 batches of leaves of B.cusia samples（n=3）　w/（μg·g-1）

［1］杨秀贤，吕曙华，吴寿金.马蓝叶化学成分的研究［J］.中草药，1995，26（12）:622-622.

［2］陈晓庆.南板蓝（马蓝）栽培的关键技术研究［D］.广州:广州中医药大学，2012:3-4.

［3］刘远，欧阳富，于海洋，等.马蓝叶化学成分研究［J］.中国药物化学杂志，2009，19（4）:273-275.

［4］安益强，贾晓斌，陈妍桦，等.高效液相色谱法测定不同产地板蓝根中2，4（1H，3H）喹唑二酮含量［J］.中华中医药杂志，2010（2）:275-277.

［5］李玲，董同义，李修禄，等.大青叶类药材及其制剂质量控制的研究［J］.药学学报，1994，29（2）:128-131.

［6］李玲，乔传卓，李修禄，等.大青叶和板蓝根药材及其制剂质量控制的研究［J］.药学学报，1993，28（3）:229-233. ［7］孙立新，宁黎丽，毕开顺，等.板蓝根和大青叶质量的化学模式识别研究［J］.中药材，2000，23（10）:609-613.

［8］梁文法，闭业范.南板蓝的根、茎、叶中靛玉红与靛蓝的含量测定［J］.中成药，1990，12（2）:31-32.

［9］沈小莉.二氢吡啶类衍生物的合成研究及大青叶等药材中三种有效成分的测定［D］.西安:西北大学，2007:45.

（责任编辑：刘晓涵）

Simultaneous determination of 5 active components in leaves of Baphicacanthus cusia （Nees）Bremek.by HPLC

ZHANG Xianda1，CHEN Yilong2，ZHANG Danyan2
（1.Baoan Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518102，China；2.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Objective To establish the HPLC method for simultaneous determination of 5 active components in leaves of Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.Methods A ZORBAX Extend-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used and eluted gradiently with the mobile phase of acetonitrile and water at a flow rate of 1 mL/min.The detection wavelength was 225 nm and the column temperature was 30℃.Results 2，4 （1H，3H）-quinazolinedione，4（3H）-quinazolinone，2-methyl-4（3H）-quinazolinone，tryptamine ketone and indigo showed good linearities within the range of 10.86-217.2 ng，16.21-324.2 ng，11.34-226.8 ng，29.85-597.0 ng and 160.5-3 210 ng，respectively.The recovery of them were among 98.5%-100.9%. Conclusion The established HPLC method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable，which could be used to control the quality standard of leaves of B.cusia.

leaves of Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.；HPLC；effective components；content determination

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0449-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051002

2016-05-10

广东省科技计划项目（2010B030700067）

张先达（1975—），男，主管药师，Email:71203955@qq.com；通信作者:张丹雁（1964—），女，教授，博士生导师，主要从事中药品种及真伪鉴别研究和中药质量标准研究，电话:02039358296，Email:danyan64@163.com。

网络出版时间:2016-07-06 10:41 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160706.1041.003.html