超高效液相色谱法测定陈皮藿香汤中4种成分的含量

庄泽荣，梁咏倩，秦楠，宋粉云（广东药科大学药学院，广东广州510006）

超高效液相色谱法测定陈皮藿香汤中4种成分的含量

庄泽荣，梁咏倩，秦楠，宋粉云
（广东药科大学药学院，广东广州510006）

目的建立超高效液相色谱法测定陈皮藿香汤中维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素4种成分质量浓度的方法。方法 以Endeavorsil C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，Dikma）柱为分离柱，流动相为甲醇（A）-0.2%（体积分数）甲酸（B），梯度洗脱。流速为0.3 mL/min，柱温为25℃，进样量为5 μL，检测波长为300 nm。结果维采宁-2在4.20～12.6 μg/mL范围内具有良好的线性关系（r=0.999 2），平均回收率为97.4%，RSD为2.38%（n=6）；橙皮苷在9.52～78.4 μg/mL范围内具有良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为98.9%，RSD为1.09%（n=6）；川陈皮素在4.00～12.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系（r=0.999 7），平均回收率为100.3%，RSD为1.71%（n=6）；桔红素在1.76～3.96 μg/mL范围内具有良好的线性关系（r=0.999 3），平均回收率为103.5%，RSD为1.22%（n=6）。结论本法操作简单、重复性好，测定结果准确，可用于陈皮藿香汤的质量控制，也可为含有该药对的中药成方制剂的质量控制提供参考。关键词：陈皮藿香汤；维采宁-2；橙皮苷；川陈皮素；桔红素；超高效液相色谱法

陈皮藿香汤始载于《医学从众录》第6卷，处方为陈皮5钱、藿香5钱，上用土澄清水2杯，煎1杯服之。以二药治霍乱吐泻，伤暑急暴［1］。陈皮藿香汤是将陈皮、广藿香作为药对配伍使用的开端，陈皮、广藿香作为药对配伍使用还有其他相关报道［2］。2015年版《中国药典》中有24个成方制剂应用此药对［3］，在《中药成方制剂》中亦有78个方剂包含此药对，然而有关该药对中成分质量分数测定的研究尚未见文献报道。陈皮主要包含了挥发油、黄酮类和部分人体所需的微量元素等多种类别的化学成分［4］；广藿香的成分主要分为挥发性成分与非挥发性成分2类［5-6］，其中广藿香油成分分析一直是研究者们关注的研究热点。而2015年版《中国药典》中分别以橙皮苷和广藿香醇作为陈皮和广藿香质量控制的指标性成分。本研究前期工作基础显示，维采宁-2为陈皮、广藿香2味药材的共有成分，橙皮苷、川陈皮素以及桔红素则来源于陈皮［7-8］。本文以陈皮藿香汤为研究对象，建立了陈皮藿香汤中维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素和桔红素4种成分质量浓度测定的超高效液相色谱法（UPLC法），可为陈皮藿香汤的质量控制提供依据，也为含有该药对中药成方制剂的质量控制提供参考。

1　仪器与试药

ACQUITY UPLC-TUV系统（美国Waters公司），二元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱；KQ5200型医用超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率25 kHz，功率100 W）；岛津AY120型托盘电子分析天平（日本岛津SHIMADZU）；TC-15恒温电热套（海宁市华星仪器厂）；中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；药典检验筛（浙江飞达金属砂筛厂）。

对照品橙皮苷（批号:110721-200512）购于中国食品药品检定研究院，维采宁-2（批号:16011122）购于上海同田生物科技有限公司，川陈皮素（批号: MUST-14060310）、桔红素（批号:MUST-141124410）购于四川成都曼斯特生物科技有限公司，经HPLC面积归一化法测定质量分数均大于98%，符合质量分数测定要求。甲醇为色谱纯（德国Merck公司），水为自制超纯去离子水，其他试剂均为分析纯。

12批陈皮药材采集于不同时间、来源于不同产地，具体见表1；广藿香于2013年11月购于广东省湛江市遂溪县，经广东药科大学中药学院中药资源系刘基柱副教授鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部标准。

表1　12批陈皮药材的批号、产地及采集时间Table 1 　The origins of 12 samples of Citri Reticulatae Pericarpium stored for different years

陈皮藿香汤为自制。制备方法:分别称取陈皮、广藿香药材各5.0 g，加去离子水100 mL煎煮至约30 mL左右，过滤到50 mL容量瓶中。洗涤药渣至无色，冷却，用去离子水定容至刻度，即得。将表1中不同产地及采收时间陈皮、广藿香按上述方法分别制备成12个批次的陈皮藿香汤，备用。

2　方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备 分别取维采宁-2、川陈皮素和桔红素对照品适量，精密称定，分别置于25 mL容量瓶中，各加入70%（体积分数，下同）甲醇，制成每1 mL分别含维采宁-2 210 μg、川陈皮素200 μg、桔红素220 μg的对照品储备液。精密称取橙皮苷适量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含橙皮苷280 μg的橙皮苷对照品储备液。分别精密量取维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素对照品储备液0.13、0.46、0.26、0.05 mL于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，制得维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素质量浓度分别为5.46、25.8、10.4、2.20 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备 精密量取陈皮藿香汤5 mL至25 mL容量瓶中，加15 mL 70%甲醇超声15 min，冷却，70%甲醇定容至刻度，滤过，取续滤液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:Endeavorsil C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，Dikma）柱；流动相:甲醇（A）-0.2%（体积分数，下同）甲酸（B）梯度洗脱，洗脱程序 0～6 min，10%A；6～8 min，10%A→15%A；8～15 min，15%A；15～25 min，25%A；25～35 min，40%A；35～38 min，80%A；38～40 min，90%A；40～45 min，10%A。进样量:5 μL；流速:0.3 mL/min；检测波长:300 nm；柱温:25℃。分别精密吸取混合对照品、供试品溶液各5 μL，按照上述色谱条件进行测定，理论塔板数以维采宁-2峰计算应不低于5 000，维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素峰的拖尾因子分别为0.88、1.15、1.14、1.14，保留时间分别约为15.1、22.5、31.5、32.6 min，4种成分峰与其他组分峰的分离度均大于1.5。色谱图见图1。

图1　混合对照品（A）、供试品（B）溶液的UPLC色谱图Figure 1 UPLC Chromatograms of reference substances（A）and samples（B）

2.3方法学考察

2.3.1陈皮藿香汤中4种成分线性关系、检测限及定量限的考察 分别精密吸取维采宁-2对照品储备液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，橙皮苷对照品储备液0.85、2.25、4.00、5.00、7.00 mL，川陈皮素对照品储备液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，桔红素对照品储备液0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL，置于25 mL容量瓶加甲醇定容，制备成5份不同质量浓度的混合对照品溶液。其中维采宁-2质量浓度分别为4.20、6.30、8.40、10.5、12.6 μg/mL，橙皮苷质量浓度分别为9.52、25.2、44.8、56.0、78.4 μg/mL，川陈皮素质量浓度分别为4.00、6.00、8.00、10.0、12.0 μg/mL，桔红素质量浓度分别为1.76、2.20、2.64、3.08、3.96 μg/mL。分别精密吸取上述混合对照品溶液5 μL注入液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件测定。以各成分峰面积（A）对对照品质量浓度（ρ）进行线性回归，得各成分回归方程。以S/N=3时的质量浓度计为检测限，以S/N=10时的质量浓度计为定量限，结果见表2。

2.3.2精密度试验 精密吸取维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素质量浓度为5.46、25.8、10.4、2.10 μg/mL的对照品溶液5 μL，按照“2.2”项下色谱条件分别连续测定6次，结果维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素峰面积平均值的RSD值分别为2.97%、0.15%、0.25%、2.31%，表明仪器精密度良好。

2.3.3稳定性试验 取同一份陈皮藿香汤（编号1）5 mL，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12 h按照“2.2”项下色谱条件进样分析，记录供试品溶液中4种成分的峰面积，结果维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素峰面积平均值的RSD值分别为1.34%、1.40%、0.62%、0.83%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.4重复性试验 取同一批陈皮藿香汤（编号1）6份，分别按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样分析，测定供试品中4种化学成分的质量浓度，结果维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素的平均质量浓度分别为0.033 9、0.193 3、0.022 8、0.009 9 mg/mL，RSD分别为2.96%、0.70%、0.63%、0.64%，表明本法重复性良好。

2.3.5加样回收率试验 分别精密量取已知质量浓度（维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素质量浓度分别为0.034 2、0.195 2、0.021 9、0.009 9 mg/mL）的陈皮藿香汤（编号1）6份，每份2.5 mL，分别精密加入维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素、桔红素质量浓度分别为210、400、200、220 μg/mL的对照品溶液0.04、1.25、0.30、0.10 mL，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果见表3。维采宁-2平均回收率为97.4%，RSD值为2.38%；橙皮苷平均回收率为98.9%，RSD值为1.09%；川陈皮素平均回收率为100.3%，RSD值为1.71%；桔红素平均回收率为 103.5%，RSD值为1.22%。结果表明本方法准确可靠。见表3。

2.4样品的测定

分别取表1中12批不同产地的陈皮药材和广藿香药材适量，按“1”项下方法制备12批陈皮藿香汤，分别量取5 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件测定，以标准曲线法计算各批次陈皮藿香汤中4种成分的质量浓度，结果见表4。

表2　陈皮藿香汤中4种成分的回归方程、相关系数、线性范围、检测限及定量限Table 2 Calibration curves，correlation coefficients，linearity range，LOD and LOQ of 4 components from Chenpi Huoxiang decoction

表3　陈皮藿香汤中4种成分的回收率试验结果Table 3 Recovery results of 4 components from Chenpi Huoxiang decoction（n=6）

表4　12批陈皮藿香汤中4种待测成分的质量浓度Table 4 Contents of 4 components from 12 batches of Chenpi Huoxiang decoction（n=3）

3　讨论

3.1供试品溶液制备方法的选择

考察了不同体积分数甲醇对提取液所得各测定组分质量浓度的影响，结果发现使用70%甲醇为溶剂时，提取效果较好；以70%甲醇为溶剂，考察了不同超声时间的提取效果，结果表明超声15 min后可以认为各成分已经提取完全。最终确定的提取方法为70%甲醇超声提取15 min。

3.2流动相的选择

尝试了多种不同比例的甲醇-0.2%甲酸流动相后发现，在15～25 min内，只有较缓的梯度比例，才可以更好地分离橙皮苷和其他相邻色谱峰。采用梯度洗脱法，经反复试验调整得到本文的流动相洗脱程序，在此色谱条件下各成分分离度和保留时间均符合要求。

3.3检测波长的选择

根据文献［7-8］报道，将对照品维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素和桔红素配制成一定质量浓度的溶液，在200～450 nm波长范围内进行紫外扫描，得到维采宁-2、橙皮苷、川陈皮素和桔红素最大吸收波长分别为320、285、332、316 nm。在此基础上，出于检测时各色谱峰的响应值要求以及降低干扰因素对质量浓度测定的影响进行综合考虑，选择300 nm为检测波长。

本试验将不同产地、不同采收时间的12批陈皮与广藿香配伍，自制成陈皮藿香汤，采用UPLC法测定陈皮藿香汤中4种成分的质量浓度。由于受到环境等外界因素影响，不同产地的陈皮质量不一，各成分质量浓度存在很大的差异，无法根据所测定的成分质量浓度判断不同产地陈皮的质量优劣。但是，根据结果显示，同一产地的陈皮与广藿香配伍制成的陈皮藿香汤，所测定成分质量浓度随药材储存时间的增加多数有上升趋势，其中橙皮苷质量浓度的上升趋势最为明显，这与文献［9-10］报道的相一致。

本试验首次建立了同时测定陈皮藿香汤中4种组分质量浓度的UPLC法，测得的各组分之间具有良好的分离度，且在一定质量浓度范围内线性关系良好，精密度高、重复性及回收率好，可为陈皮藿香汤及含有陈皮-广藿香药对的中药成方制剂的质量控制研究提供可靠参考。

［1］苏庆英.中医临床常用对药配伍［M］.北京:中国中医药出版社，2012:31.

［2］陈琳，梁咏倩，宋粉云.药对广藿香-陈皮的挥发油提取工艺及其化学成分的GC-MS研究［J］.广东药学院学报，2015，31（2）:190-197.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版一部［M］.北京:中国医药科技出版社，2015:45，191.

［4］LOTA M，DE ROCCA SERRA D，TOMI F，et al.Chemical variability of peel and leaf essential oils of mandarins from Citrus Reticulata Blanco［J］.Biochem Syst Ecol，2000，28 （1）:61-78.

［5］HU L F，LI S P，CAO H et al.GC-MS fingerprint of Pogostemon cablin in China［J］.J Pharmaceut Biomed，2006，42（2）:200-206.

［6］张广文，马祥全，苏镜娱，等.广藿香中的黄酮类化合物［J］.中草药，2001，32（10）:10-13.

［7］胡志军，陈建秋.HPLC测定不同基原陈皮药材中橙皮苷含量［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（10）:95-98.

［8］杨秀梅，王瑾，黄勤挽，等.“一测多评”法测定陈皮中3种黄酮类成分［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（11）: 45-49.

［9］林林，林子夏，莫云燕，等.不同年份新会陈皮总黄酮及橙皮苷含量动态分析［J］.时珍国医国药，2008，19（6）: 1432-1433.

［10］郑国栋，蒋林，杨雪，等.不同贮藏年限广陈皮黄酮类成分的变化规律研究［J］.中成药，2010，32（6）:977-980.

（责任编辑：刘晓涵）

Simultaneous determination of four components from Chenpi Huoxiang decoction by UPLC

ZHUANG Zerong，LIANG Yongqian，QIN Nan，SONG Fenyun
（School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To develop an ultra high performance liquid chromatographic（UPLC）method for the simultaneous determination of vicenin-2，hesperidin，nobiletin and tangeretin from Chenpi Huoxiang decoction.Methods The separation was performed on Endeavorsil C18column with methanol（A）and 0.2% formic acid（B）as the mobile phase of gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min.The column temperature was 25℃.The sample volume was 5 μL and the detection wavelength was set at 300 nm. Results The linear range of vicenin-2 was 4.20-12.6 μg/mL（r=0.999 2）.Its average recovery was 97.4% with RSD of 2.38%（n=6）.The linear range of hesperidin was 9.52-78.4 μg/mL（r=0.999 9），and its average recovery was 98.9%with RSD of 1.09% （n=6）.The linear range of nobiletin was 4.00-12.0 μg/mL（r=0.999 7），and its average recovery was 100.3%with RSD of 1.71%（n=6）.The linear range of tangeretin was 1.76-3.96 μg/mL（r=0.999 3），and its average recovery for tangeretin was 103.5%with RSD of 1.22% （n=6）.Conclusion The method is simple，accurate，reproducible，and suitable for the quality control of Chenpi Huoxiang decoction.

Chenpi Huoxiang decoction；vicenin-2；hesperidin；nobiletin；tangeretin；UPLC

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0439-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016060602

2016-06-06

上海市药物（中药）代谢产物研究重点实验室开放课题（2015SHDX1001）；国家大学生创新创业训练计划项目（201510573001）

庄泽荣（1993—），男，2013级本科生，Email:1091318015@qq.com；通信作者:宋粉云（1965—），女，教授，从事现代分析方法在中药质量控制中的应用研究，电话:020-39352136，Email:songfenyun2011@163.com。

网络出版时间:2016-07-06 10:44 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160706.1044.004.html