牡蛎酶解提取物对D-半乳糖致衰小鼠学习记忆的影响

徐 成，卢虹玉，章超桦，文彩秀，林海生（广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心（湛江），南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东湛江524088）

牡蛎酶解提取物对D-半乳糖致衰小鼠学习记忆的影响

徐 成，卢虹玉，章超桦*，文彩秀，林海生
（广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心（湛江），南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东湛江524088）

为了探讨牡蛎酶解提取物对学习记忆的影响，本研究分别利用五种不同的酶（胰酶、风味酶、中性酶、碱性酶和复合酶）对牡蛎进行酶解。观察五种酶解提取物对D-半乳糖诱导记忆损伤小鼠的作用，通过Morris水迷宫进行行为学评价，并观察小鼠体内MDA（丙二醛）和SOD（超氧化物歧化酶）水平。结果表明，5种牡蛎酶解提取物均能在空间记忆获取阶段的最后3 d显著缩短小鼠的潜伏期，其中胰酶和碱性酶酶解提取物分别从第1 d和第2 d开始就显著（p＜0.05）缩短潜伏期；在空间探索阶段5种牡蛎酶解提取物的目标象限百分比（胰酶组和中性酶组p＜0.05，其余各组均为p＜0.01）和穿越平台次数（胰酶组、复合酶组和中性酶组为p＜0.05，其余各组为p＜0.01）均显著提高。与模型组相比，胰酶、风味酶以及复合酶酶解提取物显著降低（p＜0.05）小鼠血清MDA含量；除了风味酶其他酶解提取物显著（胰酶和碱性酶组p＜0.05；复合酶和中性酶组p＜0.01）提高小鼠血清SOD含量。因此，牡蛎酶解提取物能有效地改善D-半乳糖诱导的记忆损伤，为开发具有改善记忆功能的牡蛎保健品提供了依据。

牡蛎，D-半乳糖，学习记忆

Key words:oyster；D-gal；learning and memory

学习记忆是人类大脑最重要的功能之一，很大程度上决定着人们的生活质量。与学习记忆紧密联系的机理学说众多，氧化应激学说就是广泛受到人们关注的机理之一。氧化应激学说是指机体中氧化产物和抗氧化防御物质不能达到平衡，从而导致氧化应激的产生，引起神经元细胞凋亡，影响神经递质正常水平等，从而导致学习记忆的损伤［1］。

目前国内外发现了大量的从动植物种提取出的具有改善学习记忆的活性物质，其中来源于海洋的活性物质由于其资源丰富、活性多而越来越受到人们的关注。目前海洋中具有改善学习记忆活性的物质主要有富含多不饱和脂肪酸的鱼油［2］、磷虾中的复合神经酸［3］等。牡蛎是我国主要的经济贝类之一，味道鲜美，营养价值丰富，具有“海洋牛奶”的美称。大量研究表明，牡蛎酶解提取物含有多肽、多糖、牛磺酸等多种活性物质，具有抗氧化［4-7］、抗炎［8］、抗菌［9］、抗疲劳［10］、调节免疫［11］等活性。本实验室前期研究表明，牡蛎酶解提取具有增强小鼠学习记忆的作用，但是否能够改善由慢性氧化应激导致的学习记忆损伤尚不清楚。本研究在前期基础上，拟采用5种不同的生物酶酶解牡蛎，观察5种牡蛎酶解提取物对D-半乳糖诱导的小鼠记忆损伤的作用，为牡蛎资源的高值化利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

近江牡蛎 购自广东省湛江市东风市场；昆明小鼠（6～8周龄，雄性） 许可证号SCXK（粤）2013-0002，购自广东医学院SPF级动物房；胰酶（4000 u/g）、风味酶（2万u/g）、碱性酶（20万u/g）、中性酶（5万u/g）和复合酶（10万u/g） 均为食品级，广西南宁庞博生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）剂盒 南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）试剂盒 南京建成生物工程研究所。

Morris水迷宫视频分析系统 淮北正华生物仪器设备有限公司；MK3酶标仪 MULTISKAN；pH-25数显pH酸度计 上海康仪仪器有限公司；AUY220电子天平 日本岛津；CR22GⅡ高速冷冻离心机 日本日立公司；HH-8数显恒温水浴锅、JJ-2组织捣碎机 常州澳华仪器有限公司；数显恒速搅拌器 上海申生科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎酶解液的制备 将新鲜牡蛎去壳，洗净沥干，取1000 g牡蛎肉，匀浆（10000 r/min，2 min）后平均分为5份，分别进行酶解，酶解条件见表1，酶解条件由前期预实验确定。酶解反应过程中，不断进行搅拌，加入1 mol/L NaOH保持pH恒定不变，酶解时间为5 h。酶解完成后，水浴灭酶10 min，冷却至室温，10000 r/min离心10 min，取上清液冷冻干燥，-20℃储存。

1.2.2 牡蛎水解度的测定 采用三氯乙酸沉淀法测定水解度。将牡蛎肉洗净、沥干，取3.00 g牡蛎肉采用凯氏定氮（GB 5009.5-2010）法测定总蛋白含量；分别取10 mL的五种酶酶解的牡蛎酶解液以及匀浆液，加入10 mL 12%TCA（三氯乙酸）溶液，水浴中加热30 min，4000 r/min离心15 min，取上清液，凯氏定氮测定酸溶性蛋白含量。

表1 不同酶的酶解条件Table1 The different enzymatic conditions of the different enzymes

式中：DH：水解度；A：水解后酸溶蛋白含量；B：水解前酸溶蛋白含量；C：总蛋白含量。

1.2.3 动物分组与给药 70只6～8周龄的昆明小鼠，随机分为7组（空白组、模型组、胰酶组、风味酶组、中性酶组、碱性酶组、复合酶组），每组10只。除空白组外其余6组均每日颈部皮下注射10%的D-半乳糖（100 mg/kg·d），连续6周，空白组注射等量的生理盐水。注射2周后，开始给胰酶组、风味酶组、中性酶组、碱性酶组、复合酶组的小鼠灌胃牡蛎酶解液（7.5 mL/ kg·d），模型组及正常组灌胃等量的生理盐水，连续灌胃6周，进行水迷宫实验。水迷宫实验结束后采用颈椎脱臼法牺牲小鼠，取血清待测。

1.3 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫实验［12］分为空间记忆获取实验和空间探索实验两个部分。

1.3.1 空间记忆获取实验 水迷宫实验于每日上午8∶00-12∶00时进行。水迷宫深80 cm，直径为150 cm，水温维持在22℃左右。每天提前将小鼠置于实验房间中适应半小时。每天每只小鼠训练4次，每次以半随机（semi-random）方式选择入水点，共训练5 d，以手托起小鼠令其面向池壁，轻轻放入水中。小鼠在90 s内能寻找到平台，则记录其搜寻并登上平台所需要的时间，即潜伏期（escape latency）。若小鼠在90 s内未能找到平台，则用手将其引导至平台，休息20 s，潜伏期记为90 s。每次训练完成后，将小鼠擦干并置于干的木屑里，减少低体温形成的应激。

1.3.2 空间探索实验 第6 d将水池内逃逸平台撤出，在离平台最远的位置将小鼠放入水中，记录小鼠在目标象限（即原平台所在象限）滞留时间百分比和90 s内穿越平台位置的次数。

1.4 血清SOD活性和MDA的测定

水迷宫实验完成后（禁食12 h），摘除小鼠眼球取血，4000 r/min 4℃离心10 min，取血清，-80℃保存，用于测定血清的SOD及MDA含量，检测方法按试剂盒说明书进行操作。

1.5 数据处理

采用Origin 8.0软件（Origin Lab公司）中One-way ANOVA方法对实验数据进行统计分析。数据表示为平均值±标准差（X±SD），以p＜0.05为差异显著，p＜0.01为极显著。

2 结果与分析

2.1 牡蛎酶解提取物水解度测定结果

通过三氯乙酸沉淀法测得五种酶酶解牡蛎的水解度分别如下：胰酶为36.72%、风味酶为26.22%、中性酶为30.75%、碱性酶为29.12%、复合酶为29.12%。

2.2 Morris水迷宫结果

2.2.1 空间记忆获取实验结果 由表2可知，除了模型组小鼠以外，空白组与各酶解提取物组小鼠随着时间的进行其表现都有不同程度的提高，即各组小鼠的潜伏期时间都随着训练的进行而逐渐减小。空白组与模型组相比较，空白组小鼠的潜伏期从第3 d开始均与模型组的潜伏期具有显著性的差异（p＜0.05），证明D-半乳糖能够使正常小鼠在水迷宫中的潜伏期时间增加，对小鼠的学习记忆能力造成损伤。胰酶组从第1 d开始即与模型组具有显著性差异（p＜0.05），其中第4 d的显著性达到了极显著水平（p＜0.01）。碱性酶组从第2 d开始也与模型组具有显著性差异（p＜0.05），其中第4 d和第5 d的潜伏期与模型组相比均达到了极显著水平（p＜0.01）。风味酶组从第3 d开始与模型组具有显著性差异（p＜0.05），其中第4 d的潜伏期与模型组相比显著性达到了极显著水平（p＜0.01）。中性酶组从第3 d开始与模型组相比具有显著性差异（p＜0.05），其中第4 d的潜伏期与模型组的显著性达到了极显著水平（p＜0.01）。复合酶组也从第3 d开始与模型组具有显著性差异（p＜0.05），其中第4 d的潜伏期与模型组相比显著性达到了极显著水平（p＜0.01）。通过分析第5 d各酶解提取物组和空白组小鼠的潜伏期可知，各酶解提取物组的小鼠在水迷宫记忆获取阶段均具有与正常组相当的表现（p＞0.05）。

总的来说，在空间记忆获取阶段中D-半乳糖能显著的损伤正常小鼠的学习记忆能力，而五种不同酶酶解的牡蛎提取物均能有效地缓解D-半乳糖的学习记忆损伤作用，其中胰酶和碱性酶酶解提取物具有较好的作用。

2.2.2 空间探索实验结果 在空间探索阶段，空白组、胰酶组、风味酶组、中性酶组、碱性酶组和复合酶组在目标象限的时间百分比均高于模型组（图1）。其中，胰酶组和中性酶组的目标象限时间百分比显著高于模型组（p＜0.05），而风味酶组、碱性酶组和复合酶组的目标象限时间百分比与模型组相比达到了极显著水平（p＜0.01）。与空白组相比，各酶解提取物组的目标象限百分比都高于空白组，其中碱性酶的目标象限与空白组相比达到了显著水平（p＜0.05），而复合酶组的目标象限时间百分比与空白组相比达到了极显著水平（p＜0.01）。

图1 牡蛎酶解提取物在探索阶段对小鼠目标象限时间百分比的影响Fig.1 Effect of the oyster hydrolysates on the percentage of time spent in the target quadrant

图2 牡蛎酶解提取物在探索阶段对穿越平台次数的影响Fig.2 Effect of the oyster hydrolysates on the times of crossing platform

表2 牡蛎酶解提取物在训练阶段对小鼠潜伏期（s）的影响Table2 Effect of the oyster hydrolysates on the escape latency of mice（s）in acquisition trail

由图2可知，与模型组相比，空白组穿越平台次数极显著增加（p＜0.01）；五组酶解提取物组的穿越平台次数均显著提高（p＜0.05），其中风味酶组和碱性酶组与模型组相比显著性达到了极显著水平（p＜0.01）。各酶解提取物组的穿越平台次数均与空白组相当（p＞0.05），证明各酶解提取物组的小鼠均具有与空白组正常小鼠相当的表现。综上所述，D-半乳糖能延长正常小鼠的潜伏期时间，降低目标象限百分比以及穿越目标平台的次数，证明D-半乳糖损伤了正常小鼠的学习记忆能力；而各酶解提取物能显著的缩短潜伏期时间，且能显著增加目标象限百分比和穿越平台次数，证明各酶解提取物组能有效地缓解D-半乳糖造成的学习记忆损伤。

2.3 小鼠血清SOD和MDA

由表3可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中的MDA显著（p＜0.05）高于空白组，而模型组的SOD活力极显著的低于（p＜0.01）空白组，这表明D-半乳糖引起了正常小鼠血清中MDA的升高和SOD的降低，导致氧化应激的产生。各酶解提取物组均能在不同程度上降低MDA的含量，其中胰酶组和风味酶组与模型组相比有显著差异（p＜0.05），复合酶组与模型组相比更是达到了极显著的水平（p＜0.01）。对于血清中的SOD活力来说，各酶解提取物组均能在一定程度上提高SOD的活力，其中胰酶组和碱性酶组的SOD活力显著的高于模型组（p＜0.05），中性酶组的SOD活力与模型组相比达到了极显著（p＜0.01）的水平。与空白组相比，各酶解提取物组均能使小鼠血清中的MDA和SOD恢复至空白组小鼠的正常水平（p＞0.05），其中复合酶组的MDA含量相比正常组达到了显著水平（p＜0.05）。

综上所述，D-半乳糖显著的增加了小鼠血清中MDA的含量，并降低了SOD的活力，这表明D-半乳糖引起了正常小鼠的氧化应激，而各酶解提取物组均能在不同程度上降低MDA含量和提高SOD活力，这表明牡蛎酶解提取物能有效地缓解D-半乳糖诱导的氧化应激。

表3 牡蛎酶解提取物对衰老模型小鼠血清中MDA和SOD含量的影响Table3 Effect of oyster enzymatic hydrolysates on MDA and SOD levels in the serum of senile mice

3 讨论

Morris水迷宫是目前世界上公认的评价啮齿目动物空间学习记忆的一种行为学实验，能够准确的反映动物的空间学习记忆能力。Morris水迷宫实验一般包括空间记忆获取阶段和空间探索阶段，常用空间记忆获取阶段的潜伏期，以及空间探索阶段的目标象限时间百分比和穿越平台次数等参数来衡量空间学习记忆能力。本实验采用皮下注射方式以100 mg/kg剂量对昆明小鼠进行6周的处理，结果表明D-半乳糖显著的延长了小鼠的潜伏期长短，降低了小鼠在目标象限出现的百分比以及穿越目标平台的次数。大量其他研究也表明，D-半乳糖能引起动物的空间学习记忆损伤。Peng X等［13］连续7周对wistar大鼠皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg），结果表明模型组大鼠的潜伏期时间要显著高于正常大鼠，许多类似的研究［14-15］也得到了相同的结果，这些都与本实验中得到的结果相吻合。本实验中，各酶解提取物组相对模型组来说均能在不同程度上缩短潜伏期，增加在目标象限的百分比以及穿越平台次数，使其恢复到与正常小鼠相当的水平，这表明牡蛎的酶解提取物能有效地缓解D-半乳糖对小鼠造成的空间学习记忆能力的损伤。

机体中ROS（活性氧簇）产物与抗氧化体系（Antioxidant defences）的平衡状态决定了氧化应激的程度。抗氧化体系包括SOD、CAT（过氧化氢酶）以及GPx（谷胱甘肽过氧化物酶）。机体中的ROS产物大部分都是通过抗氧化体系来清除的，当机体中产生ROS产物，SOD通过加速将超氧化物转化为过氧化氢来清除ROS产物［16］。因此，SOD活力的降低表明机体的氧化应激程度加剧。本实验中，模型组小鼠血清中的SOD活力相对正常小鼠来说显著的降低，说明D-半乳糖能降低SOD的活力，使氧化应激程度加剧。MDA是自由基作用于脂质的终产物，MDA的积累能导致蛋白质、脂质以及DNA的损伤，是氧化应激加剧的表现。本实验中，模型组小鼠的血清MDA含量与正常小鼠相比显著增加，表明D-半乳糖能导致正常小鼠产生更多的自由基，使得氧化应激状态加剧。刘克明等［17］研究表明，对昆明小鼠腹腔注射D-半乳糖（500 mg/kg）45 d后导致小鼠的MDA含量要显著高于对照组，SOD显著高于对照组。Yan-Fang Xian等［18］研究证明，小鼠皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg）导致其在Morris水迷宫中表现出学习记忆能力的损伤，且SOD、GSH、CAT的含量显著降低，而MDA含量显著增加。本实验中，各牡蛎酶解提取物组都能在不同程度上提高SOD活力和降低MDA含量，能有效地缓解D-半乳糖诱导的氧化应激。牡蛎是广泛分布在我国沿海的一种经济贝类，营养价值丰富，具有“海洋牛奶”的美称。林海生等［6］研究表明牡蛎蛋白酶解物对羟基自由基和超氧阴离子具有较好的清除作用，具有良好的抗氧化能力。牡蛎良好的抗氧化能力也与本研究中牡蛎酶解提取物能缓解D-半乳糖诱导的氧化应激状态的结果相吻合。

因此，由本研究结果可知牡蛎酶解提取物能通过缓解氧化应激来改善D-半乳糖诱导的诱导的学习记忆损伤，其改善记忆的作用机制还需要进一步深入的研究。

4 结论

本研究证明牡蛎酶解提取物能提高小鼠的抗氧化能力，有效地缓解D-半乳糖诱导的氧化应激状态，并能在水迷宫行为学实验中缩短潜伏期，增加目标象限百分比以及穿越目标平台的次数，有效地恢复了D-半乳糖引起的学习记忆能力损伤，证明五种酶（胰酶、风味酶、中性酶、碱性酶和复合酶）酶解得到的牡蛎酶解提取物具有改善学习记忆能力，为开发具有改善学习记忆的牡蛎保健制品提供了理论基础。

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Effects of enzymatic extractions from oyster on the learning and memory of senile mice induced by D-gal

XU Cheng，LU Hong-yu，ZHANG Chao-hua*，WEN Cai-xiu，LIN Hai-sheng
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center，Zhanjiang 524088，China）

To investigate its effect on learning and memory，different enzymatic extractions from oyster were obtained.Oyster was hydrolyzed by five different enzymes（trypsin，flavor enzyme，neutral enzyme，alkaline protease and complex enzyme）.Memory deficit mice were induced by D-gal.Five groups of mice were received 5 different enzymatic extractions by oral administration，respectively.Morris water maze was used to assess the spatial memory.The level of MDA and SOD were examined.The results showed that the escape latency in each group was reduced significantly in the last 3 days.And the escape latency in trypsin group and alkaline protease group was reduced significantly（p＜0.05）in the first day and the second day，respectively.In probe trial，both time spent in target quadrant and numbers of crossing platform were significantly increased （Time spent in target quadrant:trypsin:p<0.05，neutral enzyme:p<0.05，other groups were p<0.01.Numbers of crossing platform:trypsin:p<0.05，neutral enzyme:p<0.05，complex enzyme:p<0.05，other groups were p< 0.01）.The level of MDA in trypsin group（p＜0.05），flavor enzyme group（p＜0.05）and complex enzyme（p＜0.01）group was reduced significantly，respectively；while the level of SOD in all groups，except flavor enzyme group，was increased significantly，respectively（trypsin:p＜0.05 neutral enzyme:p＜0.01 alkaline protease:p＜0.05 complex enzyme:p＜0.01）.This work indicated that oyster enzymatic extractions ameliorate the memory dysfunction induced by D-gal，which suggested that oyster enzymatic extractions might be developed as a new dietary supplement for treatment of age-related diseases.

TS254.1

A

1002-0306（2016）02-0347-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.062

2015－05－29

徐成（1989-），男，硕士研究生，研究方向：水产品高值化利用，E-mail：paulxuxu@hotmail.com。

*通讯作者：章超桦（1956-），男，教授，研究方向：水产品加工及高值化利用，E-mail：zhangch2@139.com。

国家现代农业产业技术体系（CARS-48-07B）。