真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇自由基和保护酶的影响

李顺峰，李 静，王安建，田广瑞，王梦娟（河南省农科院农副产品加工研究所，河南郑州450002）

真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇自由基和保护酶的影响

李顺峰，李 静，王安建，田广瑞，王梦娟
（河南省农科院农副产品加工研究所，河南郑州450002）

为延缓鲜切双孢蘑菇的衰老进程，延长保鲜期，研究了不同真空度（0、-20、-40、-60、-80、-98 kPa）下充氮热处理对鲜切双孢蘑菇贮藏中的超氧阴离子产生速率、过氧化氢（H2O2）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性和抗坏血酸（AsA）含量的影响。结果表明，在较低真空度（-20～-60 kPa），尤其是-40 kPa充氮热处理可显著（p＜0.05）提高SOD和CAT活性，降低了鲜切双孢蘑菇超氧阴离子产生速率，减少了H2O2的积累；高真空度（-98 kPa）充氮热处理可显著提高鲜切双孢蘑菇AsA含量；真空充氮热处理可抑制鲜切双孢蘑菇贮藏中APX活性的升高。

鲜切双孢蘑菇，真空充氮，热处理，自由基，保护酶

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）肉质肥厚，营养丰富，富含碳水化合物、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等，脂肪含量低，其营养价值是水果和蔬菜的4～12倍。此外，双孢蘑菇还有一定的药用价值，中医认为其味甘性平，有提神、消食、平肝阳等作用，深受国内外市场，尤其是国际市场的青睐［1］。双孢蘑菇不仅是世界上商业化栽培规模最大、普及地区最广、生产量最多的食用菌，也是我国食用菌栽培面积最大、出口创汇最多的种类。目前栽培的双孢蘑菇主要为白色种，其新鲜子实体含水量高，在采后的贮藏运输及加工过程中极易发生变色、衰老劣变，导致产品品质下降，甚至丧失食用价值和商品价值［2］。鲜切双孢蘑菇由于对蘑菇进行了切割处理，破坏了组织细胞结构，更容易发生褐变、衰老，货架期也更短，因此，鲜切双孢蘑菇研究的关键是找到切实有效、可行的延缓褐变、衰老的措施。

新鲜果蔬经切割后，诱导组织产生超氧阴离子、过氧化氢（H2O2）等，均可破坏植物组织中正常的活性氧代谢平衡。但是，鲜切处理同时诱导果蔬启动抗氧化系统而主动防御［3］。已有研究表明，热处理可以通过提高果蔬活性氧清除酶活性而延缓果蔬的衰老，进而延长果蔬的保鲜期［4-6］。真空处理也可通过延缓果蔬的成熟与衰老，达到延长保鲜期的目的［7-9］。真空充氮热处理将二者有机结合，先通过抽真空形成低氧环境，降低组织中的含氧量，然后充入氮气以破除真空，同时用热水强行快速对双孢蘑菇进行热处理，从而去除细胞间隙的气体和抑制酶活，达到抑制褐变、延长保鲜期的目的［10-11］。鉴于此，本研究以鲜切双孢蘑菇为研究对象，采用自行开发的真空充氮热处理专利设备对鲜切双孢蘑菇在不同真空度下进行充氮热处理，研究不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇自由基和保护酶活性的影响，探讨真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇组织衰老与保护酶的影响，为其在延长鲜切双孢蘑菇保鲜期的应用提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜双孢蘑菇 采自洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司，采收后分层放入贮运保鲜箱预冷20 h后立即运回实验室冷藏，选取大小、成熟度一致、颜色洁白、无开伞、无病虫害和机械损伤的双孢蘑菇进行实验；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸、三氯乙酸、核黄素、蛋氨酸、牛血清白蛋白等 均为国产分析纯；实验用水 均为蒸馏水。

FA2004C分析天平 上海越平科学仪器有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV1800紫外可见分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器 上海博远实业有限公司医疗设备厂；控制型试管研磨机 德国IKA集团；真空充氮热处理设备 河南省农业科学院自制专利设备（专利号：ZL201120445515.4）；Revco ExF24086V超低温冰箱 美国Thermo公司；LHS-250HC-II恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 将新鲜双孢蘑菇去除菇柄，然后将其纵切为厚度5 mm的菇片，取100 g菇片分别在0、-20、-40、-60、-80、-98 kPa下进行脱氧处理，并在达到相应真空度下保持2 min，之后充入氮气使其恢复至常压，然后再重复上述操作2次，最后在40℃水中处理5 min后取出，冷却沥干表面水分，放入托盘用聚乙烯（PE）保鲜膜（氧气透过率18500%±40%cm3/m2· 24 h·atm，二氧化碳透过率134500%±40%cm3/m2·24 h· atm，透湿量33±40%g/m2·24 h）包裹后在4℃、RH85%的恒温恒湿箱中进行贮藏，每个处理重复3次，每2 d取样1次，将样品用液氮冷冻并粉碎后置-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 超氧阴离子产生速率测定 超氧阴离子产生速率参照Li等［12］和Liu等［13］的方法测定。

1.2.3 过氧化氢含量测定 过氧化氢含量测定参照Zheng等［14］方法测定。

1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性测定 SOD和CAT活性测定参照Xu等［15］和Liu等［13］的方法测定，酶液蛋白质含量参照Bradford［16］方法测定（以牛血清白蛋白为标准品制作标准曲线，y= 8.4657x+0.0460，R2=0.9908）。SOD酶活为将NBT的光还原反应抑制到对照的一半（50%）时所需的酶量为一个酶活力单位，SOD活性表示为U·mg-1蛋白·min-1。以1 min内A240降低0.1为1个酶活力单位（U），CAT活性表示为U·mg-1蛋白质。

1.2.5 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定 APX活性测定参照Khan等［17］和Jiang等［18］方法并略作修改。称取1.00 g鲜切双孢蘑菇粉，加入10 mL酶提取液（酶提取液用pH7.0的100 mmol/L磷酸缓冲液配制，内含1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），2%交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），现用现配），冰浴中充分研磨，离心（10000 r/min，2℃）15 min，上清液即为酶液。取0.2 mL酶液与3 mL反应液（反应液为0.05 mol/L pH7.0磷酸缓冲液，内含0.5 mmol/L的抗坏血酸和0.1 mmol/L的EDTA，现用现配）混合，再加入1 mL 0.3 mmol/L的H2O2启动反应，以蒸馏水为空白，测定290 nm处吸光度的变化，每30 s记录1次，记录5 min。以每分钟氧化1 μmol抗坏血酸的酶量为一个酶活力单位（U），APX活性表示为U·mg-1蛋白。酶液蛋白质含量参照Bradford［16］方法测定。

1.2.6 抗坏血酸含量测定 抗坏血酸含量参照Kampfenkel等［19］的方法测定。

1.3 数据处理与统计

所有实验平行3次，实验结果用平均值±SE表示，采用SPSS 22.0软件进行ANOVA分析（显著性水平p＜0.05），采用Origin 9.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇超氧阴离子产生速率的影响

图1 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇超氧阴离子产生速率的影响Fig.1 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on superoxide anion production rate in fresh-cut Agaricus bisporus

由图1可知，鲜切双孢蘑菇在12 d的贮藏期内，各组超氧阴离子的产生速率均呈逐渐增加的趋势。同样，Liu等［20］研究结果也表明，在2℃条件下，对照组和处理组双孢蘑菇超氧阴离子的产生速率在贮藏前3 d显著增加，直到贮藏结束12 d时都保持较高超氧阴离子产生速率，并且对照组超氧阴离子产生速率显著高于处理组。在本研究中，对照组（0 kPa）鲜切双孢蘑菇超氧阴离子的产生速率在前8 d增加了38.64%，之后超氧阴离子的产生速率快速增加，第12 d时达到最高（2.93 nmol·mg-1protein·min-1）；-40 kPa处理组在贮藏的前8 d，超氧阴离子的产生速率仅增加了约20.66%，显著（p＜0.05）低于对照组。

同时，如图1所示，较低的真空度（-20～-60 kPa）充氮热处理可以抑制鲜切双孢蘑菇超氧阴离子产生速率，相反，较高真空度（-80 kPa和-98 kPa）处理则提高了超氧阴离子产生速率。这可能是由于较高真空度严重破坏了细胞膜的结构，导致其超氧阴离子的生产速率增高。结果表明，采用-20～-60 kPa的真空度进行充氮热处理可以降低鲜切双孢蘑菇贮藏中超氧阴离子的产生速率。

2.2 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇过氧化氢含量的影响

不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇贮藏期间的过氧化氢（H2O2）含量的影响如图2所示。在贮藏期间，各组的H2O2含量均呈逐渐增加的趋势。贮藏12 d时，对照组、-20、-40、-60、-80、-98 kPa处理组的H2O2含量分别增加了160.29%、93.22%、54.60%、104.59%、133.62%、171.27%。在-60～-98 kPa条件下，随着真空度的升高，鲜切双孢蘑菇产生了更多的H2O2，这可能与细胞膜的破坏、超氧阴离子的产生及自由基清除体系如过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等有关。而在较低真空度条件下，如-40 kPa处理后，鲜切双孢蘑菇产生的H2O2含量最少且总体保持平稳，这可能是由于在该真空度条件下可以增强自由基清除能力，从而抑制了H2O2的产生或清除了H2O2。

图2 不同真空度充氮热处理处理对鲜切双孢蘑菇过氧化氢含量的影响Fig.2 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on hydrogen peroxide content in fresh-cut Agaricus bisporus

2.3 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇SOD、CAT活性影响

SOD可以通过歧化反应清除体内过多的超氧阴离子，将其转化为毒性较低的H2O2和O2，H2O2再经由CAT催化生成没有毒性的H2O和O2，从而能减少自由基对细胞的伤害［20］，并进一步延缓衰老进程的发生。不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇SOD和CAT活性的影响见图3。图3A显示，较高真空度（-80 kPa 和-98 kPa）充氮热处理鲜切双孢蘑菇SOD活性呈先升高后降低的趋势，相反的，较低真空度（-20～-60 kPa）充氮热处理鲜切双孢蘑菇的SOD活性呈升-降-升的趋势。贮藏第2 d时，-20、-40和-60 kPa处理组的SOD活性分别为对照组的0.80、1.26、1.05倍；在贮藏12 d时，-40 kPa组的SOD活性最高（0.38 μmol·g-1FW），分别比-20 kPa和-60 kPa处理组高出35.71%和8.57%。可见，-40 kPa真空度充氮热处理鲜切双孢蘑菇可以较好地保持SOD的活性。

不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇CAT活性的影响如图3B所示。与对照组（0 kPa）相比，真空充氮热处理均可提高鲜切双孢蘑菇的CAT活性，且-40 kPa处理组的CAT活性在整个贮藏期一直保持最高。结合图2中H2O2的含量变化可知，-40 kPa处理组的H2O2的含量上升较慢，这与CAT活性呈逐渐上升之势有关，而其余各组的CAT活性较低，导致H2O2含量快速上升。以上结果说明，适宜的真空充氮热处理可以延缓鲜切双孢蘑菇衰老的进程。

图3 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇SOD（A）和CAT（B）活性的影响Fig.3 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on SOD（A）and CAT（B）activity in fresh-cut Agaricus bisporus

2.4 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇抗坏血酸和APX活性的影响

由图4A可知，在0～6 d的贮藏期间，真空充氮热处理对鲜切双孢蘑菇抗坏血酸（AsA）含量的影响不大，在6～12 d时，除了-20 kPa处理组的AsA含量有所降低之外，其余各处理组的AsA含量均有所增加。对照组（0 kPa）AsA含量在贮藏6～12 d增加了15.15%，-40、-60、-80和-98 kPa处理组分别增加了11.82%、33.48%、67.03%和58.47%。这可能是由于真空充氮热处理诱导了组织细胞中AsA的合成，导致在贮藏过程中其含量的增加。Viña等［21］通过研究鲜切芹菜在不同的贮藏温度下AsA的变化，发现鲜切处理使芹菜在后期贮藏中AsA含量有所增加。这主要是由于切割处理刺激了具有防御作用的AsA的产生或合成。而且，高真空度充氮热处理能显著增加鲜切双孢蘑菇中AsA的含量。

各处理组鲜切双孢蘑菇APX活性均呈现先升后降的趋势（图4B）。然而，与对照组（0 kPa）相比，采用真空充氮热处理降低了鲜切双孢蘑菇中APX的活性。对照组的APX在第10 d达到最高值（57.49 U·mg-1protein），显著（p＜0.05）高于其他处理组。而经-40 kPa处理组的APX活性在整个贮藏期无显著变化，总体处于较低水平，表明-40 kPa真空充氮热处理抑制了APX活性。综合图4A和图4B可以看出，APX活性与AsA含量呈基本对应趋势。

图4 不同真空度充氮热处理对鲜切双孢蘑菇AsA（A）和APX活性（B）的影响Fig.4 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on AsA content（A）and APX activity（B）in fresh-cut Agaricus bisporus

3 结论

3.1 较低真空度（-20～-60 kPa），尤其是-40 kPa充氮热处理可显著提高SOD和CAT活性，降低鲜切双孢蘑菇超氧阴离子产生速率，并减少过氧化氢的积累。

3.2 真空充氮热处理可抑制鲜切双孢蘑菇贮藏中APX活性的升高，高真空度（-98 kPa）充氮热处理可显著提高鲜切双孢蘑菇AsA含量。

3.3 适宜的真空（-20～-60 kPa）充氮热处理可有效抑制鲜切双孢蘑菇自由基的产生，提高抗氧化酶的活性，延缓衰老进程。

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Effects of filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment on free radical and protective enzymes of fresh-cut Agaricus bisporus

LI Shun-feng，LI Jing，WANG An-jian，TIAN Guang-rui，WANG Meng-juan
（Institute of Agro-products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to delay senescence and prolong the shelf-life of fresh-cut Agaricus bisporus，the effects of filling nitrogen in different vacuum（0，-20，-40，-60，-80，-98 kPa）combined with heat treatment on superoxide anion production，hydrogen peroxide（H2O2）content，enzyme activities of superoxide dismutase（SOD），catalase （CAT）and ascorbate peroxidase（APX），and ascorbic acid（AsA）content of fresh-cut Agaricus bisporus under cold storage were evaluated.Results showed that lower vacuum（-20～-60 kPa），especially-40 kPa filling nitrogen in vacuum with heat treatment significantly（p＜0.05）decreased superoxide anion production and H2O2accumulation，and increased activities of SOD and CAT of fresh-cut Agaricus bisporus.Higher vacuum （-98 kPa）treatment enhanced AsA content remarkably.Filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment obviously inhibited APX activity of fresh-cut Agaricus bisporus.

fresh-cut Agaricus bisporus；filling nitrogen in vacuum；heat treatment；free radical；protective enzyme

TS255.3

A

1002-0306（2016）02-0326-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.057

2015-05-11

李顺峰（1982-），男，博士，助理研究员，主要从事农产品贮藏与加工、天然活性成分提取分离方面的研究，E-mail：lishunfeng2000@163.com。

国家自然科学基金资助项目（31301588）；河南省农业科学院自主创新基金项目（2013ZZ43）。