菠萝蜜果皮多酚超声微波协同提取工艺优化及抗氧化活性研究

蒋志国，李 斌，*，王燕华，张海德（.海南大学食品学院，海南海口570228；2.海南大学信息学院，海南海口570228）

菠萝蜜果皮多酚超声微波协同提取工艺优化及抗氧化活性研究

蒋志国1，李 斌1，*，王燕华2，*，张海德1
（1.海南大学食品学院，海南海口570228；2.海南大学信息学院，海南海口570228）

采用超声-微波协同提取技术（UMAE）对菠萝蜜果皮中多酚的提取工艺进行优化，并对抗氧化活性进行了评价。以单因素实验为基础，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取乙醇体积分数、料液比、微波功率和微波时间4因素3水平进行响应曲面分析，建立多酚得率的二次多项数学模型，分析各因素的显著性和交互作用，得到多酚提取工艺的最佳条件为：乙醇体积分数70%、料液比1∶40、微波功率75 W、微波时间12 min，多酚得率为7.19 mg/g。在该条件下，超声-微波协同提取方法提取效率优于传统水浴回流法（1.04 mg/g）、微波辅助法（5.23 mg/g）和超声辅助法（5.89 mg/g）。抗氧化活性研究表明，菠萝蜜果皮多酚提取物对DPPH自由基和ABTS自由基均有较强的清除能力，呈量效关系，其EC50值分别为101.39 μg/mL和106.60 μg/mL，表明多酚是菠萝蜜果皮抗氧化活性的物质基础。

菠萝蜜果皮，多酚，超声-微波协同萃取，响应面法，抗氧化

表1 超声波-微波协同提取波菠萝蜜多酚物质单因素实验Table1 Univariate experimrnts of UMAE for extracting polyphenols from jackfruit peel

菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）属于桑科木菠萝属，是世界著名的热带水果之一，大量种植于东南亚、印度大陆、中国南部、中非和拉丁美洲［1］，国内以海南种植最多、最集中。

菠萝蜜果肉爽脆、蜜甜、芳香浓郁，营养成分十分丰富，因此常被加工成果干、果汁、果酒等多种产品远销各地。然而，研究者对占果实总重约42%的菠萝蜜下脚料果皮的研究却甚少，主要集中在果胶的提取和利用上［2-3］，但对果皮中其他活性成分的研究鲜有报道，特别是多酚类化合物。由于近年来发现多酚类化合物能够延缓衰老、抑制人类肿瘤细胞的发生和发展［4］、降血糖和降血脂［5］、抗病毒和抗氧化等作用［6］，因而激发了人们研究和开发利用多酚类化合物的极大兴趣。

目前，对多酚化合物的提取常采用水浴振荡法［7］、超声波辅助法和微波辅助法。超声-微波协同萃取法是固体萃取中超声波法及微波法发展而来的新技术。此法充分利用超声波振动的空化作用及微波的高能作用，克服了常规超声波和微波的萃取不足，即超声波产生的振荡和搅拌作用能有效弥补微波传热、传质不均等缺陷，而微波极佳的热效应能有效地弥补超声波产热不足的问题，实现了优势互补［8-10］。国内外很多学者采用超声-微波协同萃取各种原料中的功能因子，与传统提取方法相比，均发现萃取时间更短、得率更高、效率更好［11-12］。

目前，关于超声-微波协同萃取法提取菠萝蜜果皮多酚还未见报道。因此，本文以菠萝蜜果皮为原料，利用响应曲面法对菠萝蜜果皮中多酚的提取工艺进行优化，并对抗氧化活性进行了初步评价，为实现菠萝蜜的综合利用，提高产品附加值，充分发挥海南省菠萝蜜的资源优势，并为寻找开发菠萝蜜的新途径提供一定的理论基础，为其工业化生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菠萝蜜 购于海口市万福新村农贸市场；2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH自由基） Sigma公司；2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS自由基） Sigma公司；没食子酸 Sigma公司；过硫酸钾 国药集团；福林酚试剂 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

CW-2000微波超声协同萃取仪 上海新拓分析仪器科技有限公司；FW177中草药粉碎机 成都一科仪器设备有限公司；AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；722型可见分光光度计 上海奥谱勒仪器有限公司；SHZ-DⅢ循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的预处理 新鲜的菠萝蜜果肉和果皮分离后，取菠萝蜜果皮清洗干净，并于60℃烘干、粉碎、过40目筛备用。

1.2.2 总酚含量测定 以没食子酸（GA）为对照品，参考Fang等采用的Folin-酚法［13］对菠萝蜜果皮多酚提取物及纯化物中的总酚含量进行测定，以GA当量表示样品的总酚含量。GA标准曲线：Y=0.0729X+0.0008，R2=0.9985，其中X为GA质量浓度（μg/mL），Y为吸光度值。

称取1.0 g菠萝蜜果皮粉末，超声-微波协同萃取得多酚提取液，经抽滤后用蒸馏水定容至100 mL，即为样品溶液。取1.5 mL样品溶液于25 mL比色管中，分别加入1 mL福林-酚试剂和2 mL质量分数为10% 的Na2CO3溶液，然后加入蒸馏水定容至25 mL，室温避光静置40 min，在760 nm处测定吸光值。将吸光值代入标准曲线方程和式（1）计算样品中多酚得率。

式中，Y为多酚得率（mg/g）；C为没食子酸含量（mg/mL）；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；M为样品质量（g）。

1.2.3 超声-微波协同萃取菠萝蜜果皮多酚单因素实验 称取1.0 g菠萝蜜果皮粉末，进行单因素实验（表1），研究各因素对菠萝蜜果皮多酚得率的影响。

1.2.4 响应面实验设计 在单因素实验基础上，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，安排4因素3水平实验，确定超声-微波协同萃取菠萝蜜果皮多酚的最佳工艺条件，实验因子及水平如表2。

表2 Box-Benhnken实验设计因素水平Table2 Factors and levels table of Box-Benhnken experimental design

1.2.5 抗氧化活性测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率测定 参照Y Liu等［14］的方法，略有改动。取3 mL样品溶液、0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液1 mL加入具塞试管中，混合振荡摇匀，室温避光放置30 min，以无水乙醇为空白在517 nm测定其吸光度Ai；取样品液3 mL、无水乙醇1 mL同上方法测吸光度Aj；取无水乙醇3 mL、DPPH液1 mL同上方法测吸光度A0。以BHT为阳性对照，每组实验均平行3次。样品液对DPPH的清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100。

1.2.5.2 ABTS自由基清除率测定 采用Gan CY等［15］的方法，略有改动。7.0 mmol/L的ABTS水溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液1∶1（v∶v）混合后，避光反应16 h，用95%乙醇稀释使其在734 nm处吸光值为0.700±0.005（95%乙醇为对照），作为工作液备用。取样品液0.4 mL、ABTS工作液1.6 mL于具塞试管，混合振荡摇匀，在黑暗中静置6 min，以95%乙醇为空白在734 nm处测定吸光度Ai；取样品液0.4 mL、95%乙醇1.6 mL吸光度Aj；取95%乙醇0.4 mL、ABTS液1.6 mL吸光度A0。以BHT为阳性对照，每组实验均平行3次。样品液对ABTS的清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100。

1.2.6 超声-微波协同萃取高效作用分析 为了评价提取效率，本文将超声-微波协同萃取与单独超声波辅助、单独微波辅助和传统水浴回流提取法［7］进行比较，具体对比参数设置如表3所示。

1.3 数据处理

使用Excel和Design-Expert 8.0软件对数据进行处理和分析，每组实验均重复3次，实验数据表示为平均值。

2 结果与分析

2.1 料液比对菠萝蜜果皮多酚得率的影响

图1 料液比对菠萝蜜果皮多酚得率的影响Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on polyphenols yield of jackfruit peel

在固液提取中，一般提取的活性物质会随着提取溶剂的增多而增多，但当扩散达到平衡后，活性物质的量不再随着溶剂的量增加而增加，而且，提取溶剂的增加还会对后续处理造成困难，因此需要选择合适的料液比来提取目标物。由图1可看出，开始时菠萝蜜果皮中的多酚类化合物得率随溶剂量的增大而增大，当料液比超过1∶30后，出现了随着料液比的增加多酚提取量反而减小的现象。因此选择的最佳料液比为1∶30。

2.2 乙醇体积分数对菠萝蜜果皮多酚得率的影响

图2 乙醇体积分数对菠萝蜜果皮多酚得率的影响Fig.2 The effect of ethanol volume on polyphenols yield of jackfruit peel

溶剂提取主要是利用被提取物与提取溶剂的相似相溶原理，当提取溶剂的极性与菠萝蜜果皮中多酚类化合物的极性相似时，能够最有效的将多酚类化合物提取出来［16］。由图2可知，随着乙醇体积分数的增大，多酚得率呈先增大后减小的趋势，当乙醇体积分数为60%时，多酚得率达到最大值。超过60%后，多酚得率开始逐渐降低，这是由于溶液极性增强，溶剂与多酚极性的相似程度降低，导致多酚类物质的溶解度下降［17-18］。所以60%为最优乙醇体积分数。

2.3 微波功率对菠萝蜜果皮多酚得率的影响

图3 微波功率对菠萝蜜果皮多酚得率的影响Fig.3 The effect of mcrowave power on polyphenols yield of jackfruit peel

表3 超声-微波协同萃取与其他工艺提取效率的比较Table3 Extraction efficency comparison among different processes

由图3可知，菠萝蜜果皮多酚得率刚开始随微波功率的增大而增加，这是由于微波的破壁效应、热效应，超声波的机械振动作用和空化作用，以及超声波和微波的协同作用，使得菠萝蜜果皮细胞内的多酚可以更好地释放、进入溶剂并充分混合［19］。但是微波功率超过50 W，得率反而下降，可能是由于超声-微波的热效应产生的高温使提取物的热不稳定性成分发生了分解的缘故。因此选用微波功率50 W比较适宜。

2.4 提取时间对菠萝蜜果皮多酚得率的影响

图4 超声微波时间对菠萝蜜果皮多酚得率的影响Fig.4 The effect of extraction time on polyphenols yield of jackfruit peel

由图4可知，当微波超声时间达到9 min时，多酚得率达到最大值；之后随时间的延长，多酚得率反而减少。说明微波超声9 min时多酚已提取完全，而随着多酚在空气中暴露时间的增加，有部分分解，使其得率有所降低。因此，最佳微波超声时间为9 min。

2.5 响应面法优化菠萝蜜果皮多酚提取工艺

2.5.1 响应面实验设计方案及结果 根据单因素实验结果，采用时间（X1）、功率（X2）、乙醇浓度（X3）、料液比（X4）4因素3水平设计Box-Behnken实验中心组合实验，实验方案及结果见表4。

2.5.2 数学模型的建立和方差分析 利用Design-Expert 8.0统计软件对表4数据进行多元回归拟合，得到多酚得率（Y）的二次多项回归模型方程：

此模型的方差分析结果见表5。由表5可知，模型p值小于0.0001，说明二次回归模型是极显著的。失拟项p值为0.077（＞0.05），差异不显著，未知因素对实验结果干扰小，说明残差均由随机误差引起。相关系数R2为0.9944，说明二次回归模型能够较好的反应响应值的变化，模型与实际实验拟合程度好。

从各个因素的显著性水平差异可知，对多酚得率的影响次序为：料液比＞功率＞乙醇浓度＞提取时间。其中，微波功率、乙醇浓度、液料比的一次项，时间与微波功率的交互项、时间与乙醇浓度的交互项、时间与料液比的交互项、微波功率与料液比的交互项对多酚得率的影响都达到了极显著水平（p＜0.01）；微波功率与乙醇浓度的交互项对多酚得率的影响达到了显著水平（0.01＜p＜0.05）。其因素间交互作用的响应面如图5所示，与方差分析结果一致。

表4 Box-Behnken设计方案及实验结果Table4 Experimental design and result of Box-Behnken

2.5.3 超声-微波协同工艺的优化组合及其验证 根据以上的实验结果分析以及模型拟合，利用Desig-Expert 8.0软件分析并修正后得出菠萝蜜果皮多酚提取的最佳工艺为：料液比1∶40，乙醇浓度70%，微波功率75 W，微波超声时间12 min，菠萝蜜果皮多酚得率的预期值约为7.23 mg/g。根据最佳工艺条件，进行三次平行实验所得的菠萝蜜果皮多酚得率平均值为7.19 mg/g，与预期值相接近，说明该响应面法得到的回归模型具有一定的可靠性。

2.6 抗氧化活性测定

菠萝蜜提取物的抗氧化活性测定结果如表6所示，从表6可以看出，利用超声-微波协同萃取的菠萝蜜果皮多酚提取物对DPPH自由基和ABTS自由基均有较强的清除能力，且随浓度的增加而增强，呈量效关系，其EC50值分别为101.39 μg/mL和106.60 μg/mL，抑制效果略低于阳性对照物BHT（89.29 μg/mL）。并且，多酚提取物浓度与DPPH自由基清除率和ABTS自由基的清除率之间具有较好的线性关系，R2分别为0.9657和0.9913，表明多酚是菠萝蜜果皮中具有抗氧化活性的物质基础。

表5 回归模型的方差分析Table5 Analysis of variance of the regression model

表6 菠萝蜜果皮多酚提取物抗氧化活性实验结果Table6 The antioxidant activity results of the polyphenol extracts from jackfruit peel

2.7 超声-微波协同萃取高效作用分析

为了评价超声波-微波协同提取效率，本文将其与单独超声波辅助、单独微波辅助和传统水浴回流提取法进行比较，测定结果如图6所示。由图6a可知，协同最佳工艺所得多酚得率显著高于其他三种提取工艺（p＜0.05），超声、微波、水浴回流的多酚得率分别为协同提取物的86.87%、83.44%和14.38%，其中传统水浴回流提取得率最低，为1.04 mg/g。同时由图6 b可见，协同提取最佳工艺所得提取物DPPH、ATBS值也显著高于其他三种提取工艺所得提取物（p＜0.05）。对比结果说明，超声-微波协同萃取方法提取效率最高，展现出更高的多酚得率和抗氧化活性，原因是超声-微波协同萃取法结合了超声振动的空化作用与微波的高能作用，达到优势互补，因而对植物的有效成分能快速高效的提取，且不破坏所萃取有机分子的的结构［20］。陈卫云等［21］从荔枝果肉中提取多糖时，通过比较超声-微波协同法与传统热水法、超声法、微波法，也得出了相似的结论。

图5 因素交互作用对总酚含量影响的响应面Fig.5 Response surface for interactive effects four process parameters on polyphenols yield

图6 超声-微波协同萃取与其他工艺提取效率的比较Fig.6 Extraction efficency comparison among different processes

3 结论

采用超声-微波协同技术（UMAE），通过响应面实验设计对菠萝蜜果皮中多酚的提取工艺进行了优化，其最佳工艺条件为料液比1∶40，乙醇体积分数70%，微波功率75 W，提取时间12 min。在该条件下，多酚得率为7.19 mg/g，其提取效率优于传统水浴回流（1.04 mg/g）、微波辅助法（5.23 mg/g）和超声辅助法（5.89 mg/g）。抗氧化活性研究表明，菠萝蜜果皮多酚提取物对DPPH自由基和ABTS自由基均有较强的清除能力，呈量效关系，其EC50值分别为101.39 μg/mL 和106.60 μg/mL，表明多酚是菠萝蜜果皮抗氧化活性的物质基础。因此，该方法的应用对进一步开发菠萝蜜下脚料的应用价值具有重大的借鉴意义。

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Optimization of ultrasonic-microwave assisted extraction of polyphenols from jackfruit peel and evaluation of its antioxidant activities

JIANG Zhi-guo1，LI Bin1，*，WANG Yan-hua2，*，ZHANG Hai-de1
（1.College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Information，Hainan University，Haikou 570228，China）

In order to maximize the yield of polyphenols from jackfruit peel，response surface methodology（RSM）was employed to optimize the ultrasonic-microwave assisted extraction（UMAE）conditions，and the antioxidant activities of the polyphenol extracts were evaluated in vitro.On the basis of single-factor experiments，the Box-Behnken center-composite experimental design principle was used to design the experiments and the response surface analysis with 4 factors and 3 levels was adopted.A second order quadratic equation for extraction of polyphenols was created.After analyzed the significance of various factors and their interactions，the optimal extraction conditions for polyphenols from jackfruit peel were determined as follows:70%aqueous ethanol as the extraction solvent，1∶40 as solid-liquid ratio，extraction time 12 min and microwave power 75 W.The extraction yield of polyphenols was determined to be 7.19 mg/g under the optimized extraction conditions，which were above that of traditional hot water extraction，microwave assisted extraction and ultrasonic assisted extraction（1.04 mg/g，5.23mg/g and 5.89 mg/g，respectively）.These results confirmed that UMAE of polyphenols had great potential and efficiency compared with traditonal extraction technologies.Furthermore，the experiments of antioxidant activity showed that polyphenol extracts of jackfruit peel exhibited strong antioxidant activities by the DPPH and ABTS radical scavenging assays，and the EC50were 101.39 μg/mL and 106.60 μg/mL，respectively.The present study showed that the jackfruit peel were strong radical scavengers and could be considered as a good source of natural antioxidants for medicinal and commercial uses.

jackfruit peel；polyphenols；microwave-ultrasonic assisted extraction；response surface methodology；antioxidant activity

TS209

B

1002-0306（2016）02-0270-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.046

2015-07-02

蒋志国（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品化学与营养，E-mail：jzg6666@163.com。

*通讯作者：李斌（1966-），男，大学本科，实验师，研究方向：食品化学与营养，E-mail：lzc66@21cn.com。

王燕华（1980-），女，大学本科，讲师，研究方向：统计分析，E-mail：wangyanhua0007@163.com。

海南省自然科学基金（20153157）；海南省高等学校科学研究重点项目（Hnky2015ZD-3）。