三种预处理法对酶解产大豆异黄酮苷元的影响

李笑梅，马慧玲（哈尔滨商业大学黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

三种预处理法对酶解产大豆异黄酮苷元的影响

李笑梅，马慧玲
（哈尔滨商业大学黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

以市售大豆异黄酮粉为样品，采用炒制、微波、烘箱加热法对其进行预处理，研究其对酶解大豆异黄酮转化大豆异黄酮苷元含量的影响。结果表明：炒制效果明显好于烘箱和微波法（p＜0.05），炒制后大豆异黄酮苷元含量比烘箱、微波处理后分别增加1.238、1.240 mg/g。再运用单因素、响应曲面法对炒制条件进行优化，得到最优条件为：炒制时间103 s，炒制温度137℃，物料量13 g，此时大豆异黄酮苷元含量和转化率为13.33 mg/g、72.23%。

炒制，酶解，大豆异黄酮苷元，响应曲面

大豆异黄酮（soybean isoflavone）分为游离型和结合型两种，其中结合型占总量的97%～98%。国内外研究表明，游离型生物活性高于结合型［1-3］。糖苷型的大豆异黄酮不能直接被小肠壁吸收，必须经水解去除糖基转化为游离型的苷元才可被小肠吸收［4］，所以要提高大豆异黄酮利用率，开发大豆异黄酮苷元制备技术尤为重要。大豆异黄酮苷元转化技术主要有酸碱水解法、酶水解法［5］；最主要的酶有β-葡萄糖苷酶、葡萄糖酸酶、α-半乳糖苷酶、乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等［6］；微生物降解法，对产β-葡萄糖苷酶的菌种研究主要集中在酵母、曲霉、木霉以及细菌［7］。韩慧［8］的研究表明微波、炒制、烘箱干燥更有利于大豆异黄酮苷元转化。作为工业原料的大豆异黄酮主要是结合型，且游离型含量较高的产品价格也很高。因此，研究前处理及后期酶解处理的复合方法显得尤为重要。本研究旨在探讨筛选出有效的预处理法，使经过预处理的结合型大豆异黄酮更易于酶解乃至于后续的微生物发酵，进而提高苷元转化率，为苷元制备技术的进一步开发及成果转化提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆异黄酮粉 纯度30%，河南众信生物科技有限公司；大豆素（Daidzein）、大豆黄素（Glycitein）、染料木素（Genistein）、大豆苷（Glycitin）、大豆黄苷（Glyctin）、染料木苷（Genistin）标准品 纯度99%，均购于西安市天园生物制药厂；黑曲霉β-葡萄糖苷酶南京生利德生物技术有限公司；甲醇 色谱纯，美国天地公司；超纯水 自制。

Agilent 1200LC高效液相色谱 美国安捷伦公司；TU-1901双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；G80F23DCN3L-F7格兰仕微波炉广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；AS3120A超声波 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；HZS-H恒温水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；炒锅 市售。

1.2 实验方法

1.2.1 六种大豆异黄酮标准品定性定量检测

1.2.1.1 配制大豆异黄酮混合标液 称取一定量大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素标准品，用80%甲醇溶解超声30 min后定容，配制成六种单标液，各浓度为0.4 mg/mL。再用上述六种标液以相同比例分别配制成0.048、0.096、0.144、0.192、0.24 mg/mL系列浓度大豆异黄酮混和标液［9］。

1.2.1.2 扫描最大吸收波长 用0.048 mg/mL混标在双光束紫外分光光度计中进行全波长扫描，确定最大吸收波长。

1.2.1.3 六种大豆异黄酮定性定量检测 采用高效液相色谱法进行定性定量检测，固定相为Agilent1200LC C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶水=20%～60%为流动相，进行梯度洗脱，流速为1.2 mL/min，柱温为40℃，检测波长为确定的最大吸收波长。将各单标过0.45 μm微孔滤膜于进样瓶中，依次进样，各组分保留时间作为样品的定性依据。将配制好的混合标液进样，根据峰面积绘制六种标准品的标准曲线及回归方程。

按式（1）分别计算每种大豆异黄酮含量，大豆异黄酮苷元含量由三种游离型大豆异黄酮（大豆苷、大豆黄苷、染料木苷）相加得出，结合型大豆异黄酮总量由三种结合型大豆异黄酮（大豆素、大豆黄素、染料木素）相加得出；按式（2）计算大豆异黄酮苷元的转化率。

式中：c—由各类型大豆异黄酮回归方程得出其浓度，μg/mL；m—样品量，g；v—定容体积，mL；m1—原料中游离型异黄酮含量，mg/g；m2—预处理后游离型异黄酮含量，mg/g；m3—原料中结合型异黄酮含量，mg/g。

1.2.2 大豆异黄酮原料预处理的筛选 预处理采用炒制、微波、烘箱三种方法，依据大豆异黄酮苷元含量的变化选择对应的预处理方法。

1.2.2.1 炒制及炒制加酶 称取10 g大豆异黄酮原料（含水量3%；n=3），在130℃下炒制100 s。称取0.3 g，加50 mL蒸馏水，800 W超声波超声30 min，移置离心管中，3000 r/min离心30 min，将上清液移至色谱瓶中，进行高效液相色谱检测。再取40 mL离心好的上清液，加入1 mL酶活186.053 IU/mL酶液，在45℃振荡2 h，取酶解上清液进行高效液相色谱，测定六种组分峰面积。

1.2.2.2 微波及微波加酶 称取1 g大豆异黄酮原料（厚度约1 mm；n=3），放入800 W微波炉中间歇性处理5 min，其余步骤同1.2.2.1。

1.2.2.3 烘箱及烘箱加酶 称取1 g大豆异黄酮原料（厚度约1 mm；n=3），100℃烘箱中烘1 h，其余步骤同1.2.2.1。

1.2.2.4 多重比较方差分析 运用SPSSv16.0进行数据的多重比较方差分析。

1.2.3 炒制预处理条件单因素实验 单因素实验主要考虑温度、时间、物料质量三个因素，以未经前处理的大豆异黄酮原料为对照组，采用高效液相色谱进行检测，各组实验重复三次。

1.2.3.1 温度对大豆异黄酮苷元含量变化的影响 物料质量10 g，温度70、100、130、160、190℃，炒制100 s，以峰面积为检测指标研究温度对大豆异黄酮苷元含量变化的影响。

1.2.3.2 时间对大豆异黄酮苷元含量变化的影响 物料质量10 g，在100℃下，分别炒制60、80、100、120、140 s，以峰面积为检测指标研究时间对大豆异黄酮苷元含量变化的影响。

1.2.3.3 物料量对大豆异黄酮苷元含量变化的影响

物料质量5、10、15、20、25 g，在100℃下炒制100 s，以峰面积为检测指标研究物料量对大豆异黄酮苷元含量变化的影响。

1.2.4 响应曲面法优化大豆异黄酮预处理条件 采用Box-Behnken模型，以温度、时间与物料量三个单因素为影响大豆异黄酮苷元含量的主要考察因子（自变量），分别以x1、x2、x3表示，并以-1、0、+1分别代表自变量的低、中、高水平，按方程xi=（Xi-x0）/x对自变量进行编码。其中xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，x0为实验中心点处自变量的真实值，x为自变量的变化步长，因子编码及水平见表1。并采用多元回归分析，拟合二次多项式回归模型的Box-Behnken设计实验［10］，进行结果分析，得到大豆异黄酮预处理的优化工艺条件，在此基础上，做验证实验。

表1 Box-Behnken实验设计因素水平及编码Table1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 六种大豆异黄酮标样定性检测结果

图1 大豆异黄酮紫外全波长扫描图Fig.1 All ultraviolet wavelength scannogram of soybean isoflavone

2.1.1 大豆异黄酮最大吸收波长 由紫外扫描图可以看出，确定259 nm为最大吸收波长。

2.1.2 大豆异黄酮的标准曲线 以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

图2 六种大豆异黄酮标准曲线Fig.2 Standard curve of six soybean isoflavones

峰面积y对大豆异黄酮浓度x（μg/mL）进行回归分析，回归方程见表2。

表2 大豆异黄酮标准曲线Table2 Standard curve of soybean isoflavones

2.1.3 大豆异黄酮的定性

2.1.3.1 混合标样中六种大豆异黄酮定性 根据单标的保留时间对混标色谱图各组分进行定性。由图3可知，19.200 min是大豆苷，20.700 min是大豆黄苷，24.604 min是染料木苷，36.321 min是大豆素，38.383 min是大豆黄素，41.861 min是染料木素。

图3 混合标样大豆异黄酮色谱图Fig.3 The chromatogram of six soy isoflavones in standard substance

2.1.3.2 原料中大豆异黄酮的定性定量 由图4可知，原料中各组分大豆异黄酮出峰时间与图3混合标样各组分的出峰时间相同，含有上述六种大豆异黄酮。根据相应标准曲线，计算出原料中大豆苷含量为4.187 mg/g；大豆黄苷含量为2.764 mg/g；染料木苷含量为2.242 mg/g；大豆素含量为5.661 mg/g；大豆黄素含量为0.634 mg/g；染料木素含量为0.4 mg/g。三种结合型异黄酮总含量为9.193 mg/g；三种游离型异黄酮总含量为6.695 mg/g。

图4 原料未经预处理大豆异黄酮色谱图Fig.4 The chromatogram of soybean isoflavones without any pretreatment in sample

2.2 大豆异黄酮预处理的筛选结果

三种预处理方法对大豆异黄酮苷元含量变化的影响见图5。

图5 不同预处理方法对大豆异黄酮苷元含量变化的影响Fig.5 The effect of different pretreatment methods on content of isoflavoues aglycone

由图5和表3可知，经炒制处理大豆异黄酮苷元含量比原料、烘箱和微波分别高出1.61、1.238、1.240 mg/g；烘箱和微波相比，大豆异黄酮苷元含量变化不显著（p＞0.05）。炒制后再经酶解大豆异黄酮苷元含量变化，均显著高于只经酶解和烘箱干燥、微波加酶解（p＜0.05），炒制酶解高于只经酶解2.498 mg（37.24%）。由此得出炒制预处理方法有利于酶解大豆异黄酮苷元转化，可起到增效作用。此外也可看出，酶解法是苷元转化的有效方法。

2.3 大豆异黄酮预处理的单因素实验结果

2.3.1 炒制温度对大豆异黄酮苷元转化率的影响结果 由图6可知，随着炒制温度升高大豆异黄酮苷元含量增加，当温度达到130℃时，含量达到最高；炒制温度继续增加，两组的大豆异黄酮苷元的含量开始下降，原料颜色变深逐渐炭化，有机物氧化，所以炒制适宜温度在100～160℃。马玉荣［11］研究巴氏杀菌（95℃）、高温短时杀菌（121℃）和超高温瞬时杀菌（143℃）对豆浆中苷元含量的影响，121℃处理后，豆浆中苷元型异黄酮含量增加，143℃处理后，豆浆中苷元型异黄酮含量减少，说明对于不同的样品适宜温度的热预处理方法可促进大豆异黄酮苷元的转化。

表3 多重比较方差分析Table3 Multiple comparisons variance analysis

图6 炒制温度对大豆异黄酮苷元含量变化的影响Fig.6 The effect of stir-frying temperature on isoflavoues aglycon

2.3.2 炒制时间对大豆异黄酮苷元转化率的影响结果 由图7可知，随着炒制时间增加大豆异黄酮苷元含量升高，当时间达到100 s时，含量达到最高。继续增加炒制时间，两组的大豆异黄酮苷元的含量开始下降，炒制时间继续增加，原料逐渐炭化，所以炒制适宜时间在80～120 s。

图7 炒制时间对大豆异黄酮苷元含量变化的影响Fig.7 The effect of stir-frying time on isoflavones aglycon

2.3.3 物料量对大豆异黄酮苷元转化率的影响结果

由图8可知，随着物料量的增加大豆异黄酮苷元含量升高，当物料量达到10 g时，大豆异黄酮苷元含量达到最高。继续增加物料量，两组的大豆异黄酮苷元的含量逐渐下降，大豆异黄酮苷元含量变化和加热容器大小有一定的关系，物料量厚度约在2 mm，加热较为均匀有利于大豆异黄酮苷元的转化，所以适宜物料量在5～15 g。

图8 炒制物料量对大豆异黄酮苷元含量变化的影响Fig.8 The effect of stir-frying quality on isoflavones aglycon

2.4 响应曲面法优化大豆异黄酮预处理条件结果

表4 实验设计结果Table4 Design and results of experiment

利用Design Expert软件对表4实验数据进行了多元回归拟合分析，得到了炒制加酶处理后原料中大豆异黄酮苷元的回归方程：Y=13.02-0.20x1-0.54x2-0.53x3+0.096x1x2+0.65x1x3-0.12x2x3-2.06x-1.94x-2.57x。

2.4.1 炒制加酶模型及回归方程系数的显著性检验

从表5方差分析及显著性分析结果可知，对优化得到的模型进行拟合，确定炒制加酶处理后，结合型大豆异黄酮转化成游离型大豆异黄酮的最优工艺参数。根据实验结果分析得到的R2为99.48%，校正后的R为98.81%，说明该模型可靠。建立的数学模型p＜0.0001，极显著，失拟项不显著，说明该实验能很好地拟合实验的真实情况，可用于炒制前处理的条件优化。另外模型一次项x1显著，x2、x3极显著；交互项x1x3极显著，说明炒制温度和物料量的交互对大豆异黄酮苷元含量影响显著。x1x2、x2x3不显著；二次项x、x、x均极显著。

表5 回归方程系数及显著性检验Table5 Significance test of the regression equation coefficients

2.4.2 大豆异黄酮苷元含量变化的响应面分析

图9 炒制时间、炒制温度及交互作用对大豆异黄酮苷元含量的响应面Fig.9 Response surface plot for the effect of frying time（s）and temperature（℃）on content of isoflavoues aglycone

2.4.2.1 炒制时间和炒制温度的交互作用 由图9可知，在物料量为最佳值13.00 g时，从其等高线图可以直观地看出炒制时间与炒制温度对酶解大豆异黄酮苷元含量影响不显著。随着炒制温度的上升，大豆异黄酮苷元含量逐渐增加，在炒制温度为136.93℃时，大豆异黄酮苷元含量最大后逐渐下降。随着炒制时间的增加，大豆异黄酮苷元含量逐渐增加，在炒制时间为102.80 s时，大豆异黄酮苷元含量达到最大，之后又逐渐下降。

2.4.2.2 炒制时间和物料量的交互作用 由图10可知，在炒制温度为最佳值136.93℃时，随着炒制时间的增加，大豆异黄酮苷元含量逐渐增大，在炒制时间为102.80 s时，大豆异黄酮苷元含量达到最大，之后又逐渐下降。随着物料量的上升，大豆异黄酮苷元含量逐渐增大，在物料量为13.00 g左右时，大豆异黄酮苷元含量最大，之后又逐渐下降。

图10 炒制时间、物料量及相互作用对大豆异黄酮苷元含量的响应面Fig.1 0 Response surface plot for the effect of frying time（s）and quality（g）on content of isoflavoues aglycone

2.4.2.3 炒制温度和物料量的交互作用 由图11可知，在炒制时间为最佳值102.80 s时，随着炒制温度增加，大豆异黄酮苷元含量逐渐升高，在炒制温度131.29℃左右达到最大，之后又逐渐下降。随着物料量的上升，大豆异黄酮苷元含量逐渐增加大，在物料量为13.00 g时，大豆异黄酮苷元含量达到最大，之后又逐渐下降。

图11 炒制温度、物料量及相互作用对大豆异黄酮苷元含量的响应面Fig.1 1 Response surface plot for the effect of frying temperature（℃）and quality（g）on content of isoflavoues aglycone

得到最优工艺条件：炒制时间102.80 s，炒制温度136.93℃，物料量13.00 g，此时大豆异黄酮苷元含量为13.26 mg/g；将以上数据校正为炒制时间103 s，炒制温度137℃，物料量13 g。在此基础上做验证实验，大豆异黄酮苷元含量为13.33 mg/g，此时大豆异黄酮苷元转化率为72.23%。与模型预测值相对误差为1.2%。说明响应面优化后得到的回归方程具有一定的实际指导意义。潘丽华［12］研究固定化β-葡萄糖苷酶水解染料木苷，转化率为60.02%，本实验转化率与其结果相比有所提高。

3 结论

以市售工业用大豆异黄酮原料为样品，其中六种大豆异黄酮总量达15.888 mg/g，其中游离型6.693 mg/g结合型9.193 mg/g。在酶解大豆异黄酮产生游离大豆异黄酮苷元的基础上，探讨炒制、烘箱干燥、微波前处理方法对大豆异黄酮苷元转化的促进作用。结果表明炒制效果明显好于烘箱和微波法（p＜0.05），炒制处理后大豆异黄酮苷元含量高出未处理原料1.61 mg/g；炒制后再经酶解大豆异黄酮苷元含量高于只经酶解37.24%。响应曲面法优化炒制工艺条件结果为：炒制时间103 s，炒制温度137℃，物料量13 g，在此条件下大豆异黄酮苷元转化率达到72.23%。后续还要进一步研究结合型大豆异黄酮的热稳定性、酶水解条件及微生物发酵工艺条件，提高大豆异黄酮苷元的转化率。

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Effect of three pretreatments on enzymatic hadrolysis isoflavoues aglycone

LI Xiao-mei，MA Hui-ling
（Key Laboratory of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Frying，microwave and oven heating were used to preprocess the soy isoflavones materials commercially.The influence on the content of isoflavoues aglycone which was conversed enzymatic soy isoflavones was discussed through the preprocess method.The results showed that:frying was significantly better than the oven and microwave method（p＜0.05），the content of fried isoflavoues aglycone was higher than the oven，microwave 1.238，1.240 mg/g differently.Pretreatment conditions were optimized using single factor and response surface methodology to obtain results.The corrected value were frying time 103 s，frying temperature 137℃and the amount of material 13 g.The content and conversion rate of isoflavoues aglycone could reached 13.33 mg/g，72.23%.

frying；enzymatic；isoflavoues aglycone；response surface

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0254-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.043

2015－05－26

李笑梅（1960-），女，大学本科，教授，研究方向：食品科学，E-mail：lixm0451@163.com。

黑龙江省科技厅应用技术项目（G013B203）；黑龙江省高校科技创新团队建设计划项目（2010td04）。