向日葵菌核病接种方法及品种抗病性鉴定

刘　佳,　张匀华,　孟庆林,　石凤梅,　马立功,　李易初,　刘　宇

(黑龙江省农业科学院植物保护研究所,哈尔滨　150086)



向日葵菌核病接种方法及品种抗病性鉴定

刘佳,张匀华*,孟庆林,石凤梅,马立功,李易初,刘宇

(黑龙江省农业科学院植物保护研究所,哈尔滨150086)

为建立有效的向日葵菌核病田间接种鉴定方法,以核盘菌菌丝体悬浮液和孢子悬浮液作为接种物,分别对抗、感向日葵品种在现蕾期、始花期和盛花期进行人工接种,并对接种后保湿材料和保湿时间进行比较。试验结果表明: 两种接种物均可使向日葵抗、感品种产生盘腐症状。用菌丝体悬浮液和孢子悬浮液接种时,浓度分别为10.0～15.0 g/L 和200～500个/mL,始花期接种,牛皮纸袋保湿2～4 d,即可区分出向日葵品种间抗感性差异。用此方法鉴定出13个对盘腐型菌核病表现抗病的向日葵品种。

向日葵核盘菌;接种方法;抗病性鉴定

由核盘菌 (Sclerotiniasclerotiorum) 侵染引起的向日葵菌核病是黑龙江省向日葵生产上危害最重的病害之一,对向日葵产量和品质造成很大的影响。近年来,随着我省向日葵播种面积不断增加,重、迎茬以及与核盘菌其他寄主(大豆)套种,菌核病的发生日趋加重。据记载,黑龙江省1995-1997年菌核病平均发病率在40%～70%,迎茬、重茬地绝产[1]。2009-2014年连续6年对黑龙江省向日葵产区菌核病的实地调查结果显示，菌核病的年平均发病率在30%～50%,有些地块发病率达到80%以上。因此,菌核病已成为制约黑龙江省向日葵产业发展的主要障碍[2]。目前对此病害的防治尚没有行之有效的办法,国内外学者在药剂防治和抗病育种方面虽取得一定进展,但收效不大[3]。由于核盘菌寄主范围广,子囊孢子可通过风力传播,整个生育期均能侵染,因此防治时期难以掌握[4]。生物防治尚处于试验阶段,个别田间小面积试验效果虽好,但尚未作为一种防治措施推广。因此,选育并合理利用抗病品种是控制向日葵菌核病经济、安全、有效的方法[5-8]。但是,生产上缺少良好的抗源育种材料,对抗病品种的筛选也没有统一简便的方法。本研究旨在通过田间试验,建立一种简便易行的向日葵盘腐型菌核病接种鉴定方法,为抗病育种工作及抗性品种资源的筛选提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试品种:‘丰葵杂1号’(抗病),‘7101’(感病),以及用于抗病筛选的75个向日葵品种,共计77个品种,由国家向日葵产业技术体系病虫害研究室统一提供。

供试菌株:向日葵核盘菌采自田间自然发病花盘上的菌核,经分离纯化获得混合菌种。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 000 mL,121 ℃湿热灭菌30 min[9]。

1.2试验方法

1.2.1接种物的制备

(1)PDA菌丝体悬浮液:在直径为9 cm 的培养皿内铺入15 g PDA培养基,接种向日葵核盘菌,25 ℃条件下培养 14 d,置于4 ℃备用。去除菌核后,将 PDA 菌饼粉碎,每皿按15 g 计算,加入灭菌水配制成菌丝体悬浮液。

(2)孢子悬浮液:将向日葵菌核用4%次氯酸钙表面消毒10 min,无菌水冲洗3次,埋入湿的灭菌沙中[10],置于4 ℃冰箱中保存,7周后取出洗净并表面消毒,无菌水冲洗,置于发芽盒中的沙层上保湿培养。待菌核产盘后,用小吸尘器收集子囊孢子。将收集的子囊孢子用血球计数板计数并稀释成所需浓度的孢子悬浮液。

1.2.2接种量试验

(1)PDA 菌丝体接种:将菌丝体悬浮液(10.0、15.0、20.0和25.0 g/L)均匀喷洒在向日葵花盘正面,每花盘定量5 mL,始花期每处理接种10个花盘,3次重复。然后用牛皮纸袋套住花盘。4周后揭开纸袋进行病害调查。

(2)孢子悬浮液接种:将孢子悬浮液(200、500、1 000和2 000个/mL)均匀喷洒在花盘正面,每花盘定量5 mL,始花期每处理接种10个花盘,3 次重复。然后用牛皮纸袋套住花盘。4 周后揭开纸袋进行病害调查。

1.2.3保湿材料及保湿时间试验

分别将PDA 菌丝体悬浮液(15.0 g/L)和孢子悬浮液(1 000个/mL)。均匀喷洒在花盘正面,始花期接种,每花盘定量5 mL,每处理接种 10 个花盘,3次重复,设置接种后用牛皮纸袋保湿2、4 d;接种后用黑塑料袋保湿2、4 d;接种后不罩袋5个处理,以不接种不罩袋为对照,接种4周后调查记录每花盘的病情级别,计算发病率和病情指数。

1.2.4接种时期试验

分别在向日葵现蕾期(R-4)、始花期(初期R-5.1、中期R-5.5、末期R-5.9)、盛花期(R-6)采用 PDA菌丝体悬浮液(15.0 g/L)和孢子悬浮液(1 000个/mL)进行接种,均匀喷洒在花盘正面,每花盘定量5 mL,以喷5 mL清水为对照,每处理接种10个花盘,3次重复。接种后用牛皮纸袋套住花盘。4 周后揭开纸袋进行病害调查。

1.2.5向日葵不同品种对盘腐型菌核病的抗性鉴定

根据上述接种方法试验筛选结果,对供试的75个向日葵品种采用浓度为15.0 g/L的PDA菌丝体悬浮液于始花期进行接种,每品种接10个花盘,均匀喷洒在花盘正面,每花盘定量5 mL。接种后用牛皮纸袋套住花盘。试验采用随机区组排列,小区7 m×1.4 m(2垄),3 次重复,每小区种植一个向日葵品种。垄距 70 cm,垄上埯播,株距50 cm。在接种4周后揭开纸袋进行病害调查。

1.2.6病情分级标准

0 级: 无症状; 1 级: 病斑占花盘面积<25%; 2级: 25%≤病斑占花盘面积<50%; 3 级: 50%≤病斑占花盘面积<75%; 4 级: 病斑占花盘面积≥75%。向日葵品种的抗性评价标准: 抗: 病情指数<10; 中抗: 10≤病情指数<30; 中感: 30≤病情指数<50; 感: 50≤病情指数<75; 高感: 病情指数≥75[11]。

病情指数=∑(各级别花盘数×相对级数值)/(调查总花盘数×最高病级)×100;

发病率(%)=发病花盘数/处理总花盘数×100。

2　结果与分析

2.1不同接种量对向日葵菌核病发病的影响

不同浓度菌丝体悬浮液接种试验结果(表1)表明,随着接种浓度的增加,抗病品种‘丰葵杂1号’菌核病发病率及病情指数均增高,接种浓度为20 g/L和25 g/L的病情指数和发病率显著高于接种浓度10 g/L和15 g/L的两个处理;感病品种在各处理浓度下发病率和病情指数都比较高,发病率均为100%,病情指数为89.2～100,各处理之间发病率和病情指数差异不显著;接种处理的抗、感品种发病率与病情指数均显著高于对照。

不同浓度孢子悬浮液接种试验结果(表1)表明,感病品种接种孢子液浓度为200个/mL的发病率为93.3%,其他处理发病率均达100%,病情指数为 70.8～100, 抗病品种的发病率为10%～33.3%,病情指数为3.3～20.8;抗病品种接种孢子悬浮液浓度为500、1000、2000个/mL 3个处理的病情指数和发病率差异不显著;感病品种接种浓度为1 000、2 000个/mL的处理与200个/mL处理间病情指数差异显著,但与500个/mL处理差异不显著。接种处理的抗、感品种发病率与病情指数均显著高于对照。综上，用菌丝体悬浮液和孢子悬浮液接种时,接种浓度分别为10.0～15.0 g/L和200～500个/mL时可较好地区分出品种间的抗病性。

表1　接种量对向日葵抗感品种菌核病发病的影响1)Table 1　Effects of inoculation amounts on the occurrence of Sclerotinia sclerotiorum on resistant and susceptible sunflower varieties

1) 表中数据为平均值±标准差。同一品种后不同大写字母表示在0.01水平差异显著。下同。

Data in the table are mean±SD. Data of same variety followed by different capital letters in the same column are significantly different at 0.01 level. The same below.

2.2不同保湿材质及保湿时间对向日葵菌核病发病的影响

菌丝体悬浮液接种试验结果(表2)表明,感病品种‘7101’罩袋保湿处理的发病率基本上均达100%,病情指数高于70,保湿2 d即可达到有效发病。统计分析表明,袋的材质及保湿时间对发病影响差异不显著;保湿处理的发病率均显著高于不保湿处理;抗病品种‘丰葵杂1号’保湿2 d和4 d的发病率差异不显著。牛皮纸袋处理的发病率显著高于未罩袋和黑塑料袋处理。

孢子悬浮液接种试验结果表明,感病品种‘7101’罩袋保湿处理的发病率均达100%,病情指数高于70,保湿时间2 d即可达到有效发病。统计分析表明,袋的材质及保湿时间对发病影响差异不显著;保湿处理显著高于不保湿处理;抗病品种‘丰葵杂1号’保湿2 d和4 d的发病率差异不显著。牛皮纸袋处理的发病率显著高于未罩袋处理,但与黑塑料袋处理差异不显著(表2)。

2.3不同接种时期对向日葵菌核病发病的影响

两种接种物在3个时期接种均能使向日葵发病,其中在现蕾期接种,抗病品种和感病品种的发病率和病情指数均最低,在盛花期菌丝体接种和孢子悬浮液接种后抗病品种病情指数为3.3和6.7,发病率为 6.7%和10%;感病品种病情指数分别为17.6和22.5,发病率分别为23.3%和30.0%;而在始花期接种的抗感品种菌核病发病率和病情指数均最高,抗病品种在始花期接种的病情指数为4.8～17.6,发病率13.8%～26.7%;感病品种在始花期接种的病情指数为83.3～93.3,发病率90%～100%;应用 DPS 数据处理软件对试验数据进行统计分析,抗感品种在始花期接种的发病程度均显著高于现蕾期和盛花期,而在始花期3个阶段(始花初期、始花中期、始花末期)接种的向日葵其病情指数差异不显著(表3)。

2.4向日葵品种对盘腐型菌核病的抗病性鉴定

75个参试品种中对盘腐表现抗性的有13份,包括‘赤CY101’、‘57151*52284’、‘龙葵杂4号’、‘新食葵9号’、‘赤葵2号’、‘赤葵3009’、‘NKY03-4’、‘科阳1号’、‘龙食葵3号’、‘龙食葵2号’、‘JK518’、‘JK578’、‘JK108(BC11-2)’; 中抗的21份,有‘赤葵3006’、‘新葵22号’、‘赤CY102’、‘龙葵杂7号’、‘LS06-9’、‘YS14A*Z08-34’、‘油A6’、‘油A5’、‘S31’、‘S18’、‘MSG’、‘辽丰F53’、‘NKY03-1’、‘NKY03-3’、‘NKY03-7’、‘NKY03-8’、‘LSK15’、‘巴葵138’、‘油食2’、‘宁食葵1号’、‘NK03-2’;中感的13份,感病的16份,高感的12份(表4)。

表2　保湿材质及保湿时间对向日葵菌核病发病的影响Table 2　Effects of moisturizing materials and moisture time on the occurrence of Sclerotinia sclerotiorum on resistant and susceptible sunflower varieties

表3　接种时期对向日葵菌核病发病的影响Table 3　Effects of inoculation time on the occurrence of Sclerotinia sclerotiorum on resistant and susceptible sunflower varieties

表4　向日葵不同品种抗菌核病(盘腐)接种鉴定结果Table 4　Resistance of different sunflower varieties to Sclerotinia sclerotiorum in field experiments

3　结论与讨论

向日葵菌核病可发生在向日葵生长发育的任何阶段,其表现类型多样, 遗传机制复杂,且环境条件对向日葵的抗病性有较大的影响,目前尚没有一种单一高效的抗病鉴定方法[12-13]。刘学敏等[14]采用纯培养菌丝块、向日葵立枯型菌丝和子囊孢子等材料及伤口和非伤口方法接种,对向日葵菌核病菌的田间接种材料和接种方法进行了试验。结果表明:用感染立枯型菌核病菌的茎秆制成菌丝签接种效果最佳,子囊孢子接种效果最差。杜娟等[15]以采自新疆6种不同作物上的核盘菌作为供试菌株,对植株苗期抗病性鉴定方法进行筛选,结果显示:菌丝块贴接法和草酸浇灌法都能用于抗性植株的筛选,且30 mol/L草酸浇灌法可作为苗期鉴定抗病性的一种快速简便的方法。孟庆林等[16]以菌核病菌菌丝体悬浮液和高粱粒菌丝体作为接种物,分别对不同抗感向日葵品种在始花期和盛花期进行人工接种,从而筛选出最佳接菌物类型、浓度及接种时期,试验结果表明:两种接种物均可使向日葵感病品种产生盘腐症状。始花期接种较盛花期可获得更高的发病率及病情指数。本研究结果表明:采用菌丝体悬浮液与孢子悬浮液接种均可使向日葵发生盘腐症状,菌丝体悬浮液浓度在10～15 g/L之间接种效果较好,孢子悬浮液浓度在200～500个/mL之间接种效果较好;菌丝体悬浮液接种的优点在于菌株容易培养,获取方便,缺点是定量困难,菌量误差较大,而孢子悬浮液接种可精确定量,减少试验误差,但孢子收集较为困难,且收集的孢子难以保存。对于盘腐的抗性鉴定接种时期应选择始花期接种,接种后牛皮纸袋保湿2～4 d即可,试验中用牛皮纸袋套住花盘 4 周,是为了排除田间自然致病菌对本试验的干扰。用此方法鉴定了75个向日葵品种,筛选出13个抗性的品种。本研究所建立的田间接种方法能够有效地对向日葵进行抗菌核病筛选和鉴定。本试验是在不破坏寄主组织并接近田间自然条件下筛选出的抗性材料,对抗病育种更有实际意义。

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(责任编辑：杨明丽)

Inoculation methods ofSclerotiniasclerotiorumon sunflower heads and identification of variety resistance

Liu Jia,Zhang Yunhua,Meng Qinglin,Shi Fengmei,Ma Ligong,Li Yichu,Liu Yu

(Institute of Plant Protection, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin150086, China)

In order to establish the effective field inoculation method ofSclerotiniadisease, theS.sclerotiorummycelia suspension and spore suspension were used as the inoculums to inoculate the resistant and susceptible varieties of sunflowers, respectively, during the squaring period, early flowering season and full-bloom period. Effects of moisture material and moisture retention time on occurence ofS.sclerotiorumwere also compared. The results showed that both inoculation methods could make infection of both resistant and susceptible varieties of sunflowers byS.sclerotiorum. Inoculated with the mycelium suspension and spore suspension at the concentrations of 10.0-15.0 g/L or 200-500 spore/mL during the early flowering period with kraft paper moisture for 2-4 d, the difference between the resistant and susceptible varieties of sunflowers could be differentiated immediately. With this identification method, 13 sunflower varieties were identified to be resistant to the sclerotinia rot.

Sclerotiniasclerotiorum;inoculation method;identification of disease resistance

2015-03-09

2015-04-27

国家现代农业(向日葵)产业技术体系(CARS-16)

E-mail:yhzhang9603@126.com

S 435.655

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.024