西瓜回交世代酸味株系基因型分析

高 磊，赵胜杰，路绪强，何 楠，朱红菊，豆峻岭，张 莉，刘文革

（中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.&Na⁃kai]是一年生蔓性草本植物，属于葫芦科西瓜属。因其营养丰富，味甜多汁，是夏季消暑解渴的佳品，有夏季“水果之王”的美誉，在世界园艺产业中占有重要地位。据联合国粮农组织2014年统计，世界上西瓜的种植面积达到了蔬菜种植面积的9.5%。

随着人们生活水平的提高，消费者对西瓜的品质提出了更高要求，因此培育优质的西瓜品种，满足人们的消费需求就显得尤为重要。西瓜果实品质主要包括商品品质、感官品质和营养品质等方面。有机酸的组分与含量是影响果实品质的重要因素，对果实的营养品质和代谢起重要作用［1-2］。同时有机酸对人体有重要的营养价值，苹果酸具有天然香味，口味柔和，有利于人体氨基酸吸收；而柠檬酸则具有温和爽快的酸味，可以增进食欲，并促进体内对钙、磷的吸收。随着人们生活习惯的改变，不同的消费者对酸甜口味有不同的偏好，当果实的含糖量较高时，酸含量较高的果实更受喜爱［3］。新疆农业科学院哈密瓜研究中心已成功培育出一系列酸甜可口的风味甜瓜品种，具有广阔的应用前景［4］。而目前种植的西瓜作物基本上是以甜味为主的品种，具有酸甜口味的西瓜品种尚处于市场上的空白期，因此培育酸甜可口的西瓜新品种，来弥补市场空缺，调整产业结构，就成为摆在西瓜育种家面前的一项重要任务。要达到这一目的，首先就需要了解西瓜果实有机酸含量形成的生物学基础。

果实有机酸含量是复杂的数量性状，主要受遗传因素的控制，同时受自然环境和栽培措施等因素的共同影响。甜瓜果实中的有机酸主要以柠檬酸为主，还含有苹果酸、琥珀酸等［5］。张红［6］研究认为甜瓜果实总酸含量和酸度（pH）受一对主基因+多基因混合遗传模型控制，而柠檬酸含量则主要受两对主基因+多基因混合遗传模型控制。针对西瓜果实中有机酸相关方面的研究不多，主要集中在成熟西瓜果实中有机酸的种类和含量，且结果也不一致。西瓜成熟果实中的有机酸含量总体偏少，主要成分是苹果酸和柠檬酸，同时还含有少量的甲酸［7］。也有研究者认为成熟西瓜果实中的有机酸主要是苹果酸和柠檬酸，还有微量的琥珀酸和富马酸［8-9］。同时又有研究者认为西瓜果实中的有机酸主要是苹果酸和酒石酸［10-11］。因此可将西瓜归结为苹果酸积累型果实。

由于受西瓜种质资源的利用限制，使得对西瓜果实有机酸的研究较少，因此尚未见到与西瓜果实有机酸相关的分子生物学方面的报道。本试验通过连续多代回交和SSR分子标记研究对BC7F1世代进行果实酸味株系基因型分析，所获得的与有机酸含量相关的导入系群体，其酸味能稳定遗传，是研究有机酸合成复杂性状的良好材料，为有机酸合成途径关键基因的精细定位和克隆奠定基础，同时也丰富了西瓜的种质资源类型，有助于选育酸甜风味的西瓜新品种。

1 材料与方法

1.1 供试材料及群体构建

试验材料‘203Z’为中国农业科学院郑州果树研究所多倍体西瓜课题组经过多代自交的西瓜栽培品系（C.lanatus ssp.vulgaris），果实中心可溶性固形物含量11.5%左右，pH值6.5左右；‘PI 271769’为非洲野生西瓜（C.lanatus ssp.lanatus），果实中心可溶性固形物含量4.0%左右，pH值4.6左右。以‘203Z’为母本、‘PI 271769’为父本杂交获得 F1代，再以‘203Z’为轮回亲本，经过7代连续回交，在BC7F1世代发现了果实具有酸味的西瓜株系。田间试验于2011年3月至2015年7月在河南省中牟县和新乡县试验基地进行。除野生西瓜外，所有试验材料均以‘新土佐’南瓜为砧木，采用嫁接吊蔓栽培，单蔓整枝，第2雌花留单瓜，在大棚内按常规栽培方式进行管理。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取及DNA低pH、高pH池的构建 利用改良的CTAB法[13]提取西瓜幼苗基因组DNA，用核酸蛋白检测仪及1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，-20℃保存备用。根据BC7F1世代果实酸味pH值鉴定结果，分别选取10个果实低 pH 值（4.71～5.02）和高 pH 值（6.16～6.49）的单株DNA样品等量进行混合，构建DNA低pH池和DNA高pH池，用于SSR标记分析。

1.2.2 SSR标记分析 试验选取的SSR引物[14]，由上海博彩生物科技有限公司合成。PCR扩增反应体系为 10 μL，包含 0.5 μL 模板 DNA（50 ng·μL-1），正向和反向引物各 0.6 μL（10 μmol·L-1），1 μL 10×buffer，0.2μL dNTP（10 mmol·L-1），0.1 μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1），7 μL 去离子水。扩增程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性 20 s，50～60℃（根据不同引物确定不同退火温度）退火20 s，72℃延伸90 s，35个循环；最后72℃延伸8 min。PCR产物在4℃保存。扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后照相进行带型统计，与供体亲本‘PI 271769’带型一致的记为 A，与轮回亲本‘203Z’带型一致的记为B，两亲本均有的带型记为H。

1.2.3 西瓜中心果肉pH调查 果实成熟收获后，沿纵轴平均切成两半取中心瓜瓤进行匀浆，采用酸度计测其pH值；中心瓜瓤用液氮保存，用作果实有机酸含量的测定。

1.2.4 有机酸组分含量的测定 有机酸组分的提取参照王轩［12］的方法改进后进行。准确称取5 g试样（鲜质量），加入25 mL去离子水，80℃水浴提取30 min，冷却，定容至50 mL，过滤，取5 mL依次过Dionex OnGrard II1cc Cartridge固相萃取小柱和0.22 μm孔径滤膜。滤液上离子色谱测定，在中国农业科学院果树研究所农业部果品及苗木质量监督检验测试中心进行。

1.2.5 数据统计与分析 每个表型数据取3次平均值，采用SPSS 16.0数据分析软件进行统计分析；利用Graphical GenoTypes（GGT）软件进行世代基因型分析。

2 结果与分析

2.1 亲本多态性引物的筛选

选取在西瓜11条染色体上均匀分布的185对SSR引物对轮回亲本‘203Z’、供体亲本‘PI 271769’及F1代进行多态性筛选（图1），结果发现有97对引物在两个亲本材料之间出现多态性差异，多态率为52.4%，且多为共显性标记，说明两个亲本材料之间遗传基础差异较大。

图1 部分SSR标记在两个亲本及F1上的扩增结果

2.2 西瓜果实中心部位有机酸含量分析

在BC7F1世代，对果实性状调查发现有果实酸味的材料，选择其中的10个单瓜进行有机酸含量测定（表1）。可以看出，西瓜果实中心部位的pH值变化范围为4.70～5.02；有机酸主要是苹果酸，平均质量分数为 3.708 mg·g-1，变化范围为 2.591～4.538 mg·g-1；其次是柠檬酸，平均质量分数为0.538 mg·g-1，苹果酸和柠檬酸构成了西瓜果实的主要有机酸，占绝大比例；此外还有少量的甲酸、乳酸、琥珀酸及富马酸。果实酸味株系与轮回亲本‘203Z’相比，尽管‘203Z’有较高的柠檬酸含量，但酸味果实株系有较低的pH值和特别高的苹果酸含量，推测有供体亲本的染色体片段已渗入到BC7F1世代果实酸味的单株中。

表1 亲本及BC7F1世代部分果实酸味单株有机酸含量

2.3 BC7F1世代SSR筛选

选择在亲本之间具有多态性的97对SSR引物在‘203Z’、‘PI 271769’和通过 BC7F1世代单株构建的低pH、高pH池中进行筛选，结果有4对SSR标记（表2）在低pH、高pH池之间出现差异条带，其中在低pH池中扩增出来的为杂合带型，而在高pH池中扩增出来的带型与轮回亲本‘203Z’一致。

表2 在低pH与高pH池之间具有差异条带的SSR引物序列

图2 BC7F1世代单株3-10基因型分析

2.4 BC7F1单株基因型分析

选择BC7F1世代果实酸味株系中的其中一个单株3-10进行基因型分析（图2），可以发现：在西瓜的第6和第10染色体上存在2条不同长度的来源于供体亲本‘PI 271769’的外源片段，长度分别为3.65 cM和8.80 cM，且为杂合片段，外源片段总长度为12.45 cM，而构建的图谱总长度为772.8 cM，背景回复率为98.4%，而理论上BC7世代背景回复率为99.2%。

2.5 BC7F1世代果实酸味株系基因型比较分析

通过对选择的BC7F1世代10个果实酸味株系的基因型进行比较（图3），可以看出：每个单株存在2～4个不等的外源野生片段，有6个以上的不同单株在西瓜的第2、第6和第10染色体上都存在外源野生片段，获得了由野生西瓜‘PI271769’为供体亲本，栽培种西瓜‘203Z’为轮回亲本的高代回交导入系群体。

图3 BC7F1世代10个果实酸味株系基因型比较

3 讨论

本试验以栽培种西瓜‘203Z’为轮回亲本、野生西瓜‘PI 271769’为供体亲本，通过离子色谱法，检测到两个亲本及BC7F1世代个体中成熟果实中心部位的有机酸主要为苹果酸，其次是柠檬酸，此结果与王坚［7］、Dune［8］、刘景安［9］的研究结果相一致。但也有研究认为［10-11］，西瓜成熟果实中的有机酸主要为苹果酸和酒石酸，推测造成这种差异的原因可能是试验材料的不同。刘慧英［10］还详细研究了不同嫁接西瓜与自根西瓜果实动态发育中有机酸组分的变化规律，认为嫁接西瓜与自根西瓜相比，在发育后期有机酸含量降低。本试验中除野生西瓜‘PI 271769’外，均进行嫁接栽培，对‘203Z’和 BC7F1世代个体有机酸含量的测定不会造成影响，所以BC7F1世代个体和‘203Z’相比，有机酸含量较高是有意义的。

BC7F1世代的10个单株其果实与轮回亲本‘203Z’相比，pH值偏低，苹果酸和柠檬酸含量较高，其他可测性状基本一致，并且西瓜果实有机酸含量呈现连续变异的特点，属于典型的数量性状，是由多个基因共同控制有机酸的合成，因此可以推测BC7F1世代果实酸味株系中渗入的一个或多个外源野生片段存在着控制西瓜果实有机酸合成的关键基因。

通过连续多代回交获得的导入系群体，其遗传背景与轮回亲本较一致，只含有少量的外源片段，消除了大部分遗传背景的干扰，是进行目标基因精细定位的良好材料。目前已通过构建导入系群体对多个植物的重要农艺性状基因进行了精细定位和克隆［15-17］。本试验连续回交7代，获得了只在有机酸含量方面有差异的导入系群体，对有机酸合成途径关键基因的精细定位和克隆提供了良好的试验材料，同时也为开发利用野生酸西瓜的优异基因提供了良好的种质资源。

随着西瓜全基因组测序的完成［18］和高通量测序技术的发展，已构建了多张有关西瓜的高密度遗传连锁图谱［19-21］，对西瓜重要的复杂农艺性状的研究具有重要意义。本试验利用分布在西瓜11条染色体上的97对SSR标记构建了含有772.8 cM的遗传连锁图谱，没有完全覆盖整个西瓜基因组，同时在某些标记之间遗传距离较大，可能会遗漏某些目标外源片段。获得含有供体亲本的外源片段距离较大，候选基因太多，还无法确定哪些关键基因与有机酸的合成途径有关，这需要进一步缩短外源片段的长度，对目标基因进行精细定位。

通过对两个亲本进行重测序，可以开发新的分子标记来增加标记的数量，构建高密度的遗传连锁图谱，结合已构建好的导入系群体，从而实现西瓜果实有机酸合成关键基因的精细定位和克隆，解析这一复杂性状，同时利用这一具有酸味的西瓜创新种质资源，选育具有酸甜风味的西瓜新品种，更好地为西瓜生产者和消费者提供服务。