水稻半矮秆基因 sd1功能标记的开发与利用

徐建军，张云辉，顾 啸，姚麒麟*（上海市松江区农业技术推广中心，上海　06；江苏省农业科学院粮食作物研究所，南京　004）

水稻半矮秆基因sd1功能标记的开发与利用

徐建军1，张云辉2，顾 啸1，姚麒麟1*
（1上海市松江区农业技术推广中心，上海201611；2江苏省农业科学院粮食作物研究所，南京210014）

开发利用已克隆的水稻株高相关基因的分子标记用于分子育种，对水稻理想株型的育种具有十分重要的意义。通过开发水稻半矮秆基因sd1的功能标记，利用该标记对国内外99份水稻品种的sd1基因位点进行了分子检测，为分子标记辅助选择育种提供了有利工具。

水稻；sd1；功能标记；分子标记辅助选择

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约有50%以上的人口以稻米为主食。20世纪60年代，在世界范围内，半矮秆基因sd1的利用使水稻育种发生了革命性变化，水稻产量得到了大幅度提高，被称为第一次“绿色革命”。尔后，大量的矮秆基因被不断挖掘利用，给水稻生产带来了巨大的经济效益。

在当前的水稻理想株型育种中，株高仍然是备受关注的性状之一。选育株高适中的水稻品种，一方面能够优化株型，提高收获指数，降低秸秆还田的压力；另一方面能够提高耐肥性和抗倒能力。目前，在水稻理想株型育种中，应用最广泛的株高基因仍然是半矮秆基因sd1。sd1基因位于在水稻第1染色体长臂末端。石春海等［1］通过田间性状调查，结果表明sd1在抑制节间伸长的同时，还可以促进有效穗数、结实率和收获指数的提高，且不影响抽穗天数、每穗粒数和千粒重。SASAKI等［2］、MONNA等［3］、MADOKA等［4］、SPIELMEYER等［5］从分子水平揭示了sd1水稻株高降低而产量不受影响的原因。

随着生物技术的发展，分子标记辅助选择育种为传统育种注入了新的活力。与传统育种的单一表型选择相比，分子标记辅助选择育种具有快速、准确、不受环境条件影响等优点。开发与sd1基因紧密连锁或基因内的分子标记，将为水稻株高的改良提供有利工具。截至目前，EUN等［6］、CHO等［7］、OGI等［8］、王松文等［9］开发了一些与sd1基因连锁的分子标记；但是，sd1基因内标记的开发和应用还未见报道。本研究将开发sd1基因内分子标记，为分子标记辅助选择育种提供工具。

1　材料与方法

1.1供试材料及水稻DNA的提取

供试材料为来源于国内外的99份水稻品种。其中籼稻11份，粳稻88份；国外28份，国内71份；国外品种主要来自朝鲜、韩国和日本，分别为3份、5份和20份；国内品种主要来源于江苏、黑龙江、河南、四川等省。在水稻分蘖盛期，剪取新鲜叶片，采用CTAB法提取DNA［10］。

1.2分子标记开发

分子标记开发基于日本晴序列，借助Primer Premier 5.0软件，设计InDel分子标记。

1.3分子标记分析

PCR扩增反应采用25μL PCR反应体系：2.5μL模板DNA（1 ng/μL），正反引物各1.25μL （0.1μmol/L），2.5μLdNTPs（0.25 mmol/L），2.5μL 10×Buffer（不含Mg2+），2.5μL 25 mmol/L Mg2+，0.2μL Taq酶（5 U/μL），12.3μLddH2O。

PCR反应程序：95℃预变性5 min，接着94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，33个循环后72℃补充延伸10 min，最后4℃保温。

PCR扩增产物通过3.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离，利用UVP凝胶成像系统进行成像拍照。

2　结果与分析

2.1sd1基因内分子标记的开发

根据RGP（Ricegenome annotation project）基因注释，sd1基因在‘日本晴’序列图谱对应的位置是38381423-38384165 bp（5’-3’）。利用sd1基因的序列，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站与‘9311’序列进行比对，发现该基因在这2个测序品种之间，存在383 bp的插入缺失。利用该插入缺失，基于‘日本晴’序列，借助Primer Premier 5.0软件，设计了1对InDel分子标记。标记命名为：InDel-sd1。标记序列为，F：5’AGCTGGACATGCCCGTGGTC 3’，R：5’TTGAGCTGCTGTCCGCGAAG 3’。‘日本晴’PCR产物为606 bp，‘9311’的PCR产物为223 bp。

2.2InDel-sd1的分析

以水稻品种‘日本晴’和‘9311’为模板，通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和 UVP凝胶成像系统成像，对分子标记InDel-sd1进行分析，结果如图1。从图1可以看出，分子标记InDel-sd1条带清晰，PCR产物大小准确，为共显性标记，能够准确区分‘日本晴’和‘9311’两个品种sd1基因位点的基因型。前人研究表明‘9311’的sd1基因位点为突变型，隐性半矮秆基因型，‘日本晴’sd1位点为野生型，显性高秆基因型［11］。所以，本标记能够准确区分这两种基因型，为该标记在分子标记辅助选择育种提供了有力的工具。

2.3InDel-sd1的应用

图1　InDel-sd1的电泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of InDel-sd1

利用分子标记InDel-sd1，对上述99份水稻品种的sd1基因位点进行了基因型分析。结果表明：‘9311’‘南粳35’‘02428’‘关东98’‘明之星’‘九稻3号’‘水原264’‘密阳23’‘当育3号’‘皖稻77’‘川米2号’‘川新糯’‘内中124’等13份水稻品种的sd1基因位点与‘9311’一致，为突变型。其中，粳稻5份，籼稻8份。部分水稻品种的基因型分析结果如图2。其余86份水稻品种的sd1基因位点为与‘日本晴’一致，为野生型。

3　结论与讨论

EUN等［6］、CHO等［7］开发了与sd1基因连锁的分子标记，并利用它们进行分子标记辅助选择。OGI等［8］开发了1个与sd1基因紧密连锁的RFLP标记。王松文等［9］开发了2个基于PCR的sd1基因紧密连锁的标记，分别于sd1基因的遗传距离为4.4 cM和9.01 cM。但是，上述开发的标记均为连锁标记，在实际应用过程中，由于重组事件的发生，可能导致检测结果的偏差。截至目前，sd1基因内标记的开发和应用还未见报道。本研究基于测序品种‘9311’和‘日本晴’，开发了半矮秆基因sd1的基因内分子标记，为理想株型的分子育种提供了有用工具。本研究开发的基于PCR的基因内分子标记，检测方法方便快捷，检测结果准确可靠，比前人开发的连锁标记更具应用价值。

本研究利用新开发的分子标记，检测了99份来源于国内外的水稻品种，一方面验证了新标记的准确性和实用性，另一方面明确了‘9311’等13份水稻品种的sd1基因位点为突变型，为理想株型育种提供了材料基础。

图2　22个水稻品种　sd1基因位点的基因型分析Fig.2　Genotype analysis ofsd1gene loci of 22 rice varieties

［1］石春海，申宗坦.水稻半矮秆基因sd1对农艺性状的影响［J］.中国水稻科学，1996（1）：13-18.

［2］SASAKI A，ASHIKARI M，UEGUCHI-TANAKA M，et al.A mutantgibberellin-synthesisgene in rice［J］.Nature，2002，416：701-702.

［3］MONNA L，KITAZAWA N，YOSHINO R，et al.Positional Cloning of Ricesemidwarfinggene，sd-1：Rice“Green Revolutiongene”Encodes a Mutant Enzyme Involved ingibberellinsynthesis［J］.DNA Research，2002，9（1）：11-17.

［4］MADOKA A，TAKAHIRO K，MIKIKO K，et al.Gibberellin biosynthesis andsignal transduction is essential for internode elongation indeepwater rice［J］.Plant，Cell&Environment，2014，37（10）：2313-2324.

［5］SPIELMEYER W，ELLIS M H，CHANDLER P M.Semidwarf（sd-1），“green revolution”rice，contains adefectivegibberellin 20-oxidasegene ［J］.Proceedings of the National Academy ofsciences，2002，99（13）：9043-9048.

［6］EUN M Y，CHO Yg，CHUNG TY.Molecular markers linked tightly withsemidwarf（sd-1）character andshattering habits in rice［J］.Koreansoc Mol Biol，1991，4：182-185.

［7］CHO Yg.Genetics of esterase isozymes and RFLP markers，and their linkage with asemidwarfgene（sd-1）in rice（Oryzasativa L.）［D］.seoul：Seoul National University，Republic of Korea，1992.

［8］OGI Y，KATO H，MARUYAMA K，et al.Identification of RFLP markers closely linked to thesemidwarfinggene at thesd-1 locus in rice［J］. Japan J Breed，1993，43：141-146.

［9］王松文，施利利，王妮妮，等.水稻sd-1基因分子标记的建立［J］.天津农学院学报，2000，7（2）：52.

［10］PANAUD O，CHEN X，MCCOUCHs R.Development of microsatellite makers and characterization ofsimplesequence length polymorphism （SSLP）in rice（Oryzasativa L.）［J］.Molgengenet，1996，252：597-607.

［11］陈仁霄，张所兵，朱镇，等.籼稻9311HR-T显性高秆基因的初步定位［J］.江苏农业学报，2008，24（5）：553-558.

（责任编辑：张睿）

Development and application of co-segregated marker forsemi-dwarfgenesd1 in rice（Oryzasativa L.）

XU Jian-jun1，ZHANG Yun-hui2，GU Xiao1，YAO Qi-lin1*
（1Songjiang Agricultural Technology and Popularization Center ofshanghai，Shanghai 201611，China；2Institute of Food Crops of Jiangsu Academy of Agriculturalsciences，Nanjing 210014，China）

Development and application of molecular markers for cloned plant height relatedgenes is ofgreatsignificance in rice breeding for ideal plant type.A co-segregated functional marker ofsemi-dwarfgenesd1 in rice wasdeveloped，and thesd1 locus of 99 rice varieties at home and abroad wasdetected by the marker.The results provided favorable tools for marker assistedselection breeding in rice.

Rice；sd1；Functional marker；MAS

S511

A

1000-3924（2016）04-022-03

2015-06-08

上海市科技兴农“农业种植资源创新与良种良法配套技术集成应用”项目“地方特色品种资源开发应用”课题［沪农科种字（2014）第3-1号］

徐建军（1983—），男，博士，高级农艺师，研究方向：农业技术推广。Tel：021-57866226；E-mail：rilitianlang991983@163.com

，Tel：021-67835172；E-mail：sj_yaoqilin@163.com