1,25-二羟基维生素D3通过诱导基质金属蛋白酶7的表达上调小鼠肠道中活性防御素

陈子硕，刘　誉

（四川大学生命科学学院，四川 成都 610064）

1,25-二羟基维生素D3通过诱导基质金属蛋白酶7的表达上调小鼠肠道中活性防御素

陈子硕，刘誉

（四川大学生命科学学院，四川 成都 610064）

为探索维生素D对肠道先天免疫抗菌肽——α-防御素1（alpha-1-defensin，DEFA1）剪切酶基质金属蛋白酶7 （matrix metalloproteinase 7，MMP-7）的调控，利用维生素D受体基因敲除小鼠（Vitamin D receptor knock-out，VDR-KO）与肠道细胞系作为研究模型，通过免疫组化染色、qRT-PCR及免疫印迹等研究方法，发现其肠道细胞中MMP-7的转录水平与蛋白水平较野生型（wild type，WT）小鼠显著降低，并且DEFA1的表达量也较低，表明维生素D可以调控肠道MMP-7的表达，从而影响DEFA1的成熟。同时，体外细胞实验表明：1，25-二羟基维生素D3能够上调肠道细胞MMP-7的转录水平和蛋白水平。初步表明，维生素D通过调控MMP-7的表达影响DEFA1的成熟，而维生素D缺失，MMP-7下调从而DEFA1下调，进一步可能造成肠道菌群失调，导致多种慢性疾病的发生。

1，25-二羟基维生素D3；维生素D受体基因敲除鼠；基质金属蛋白酶7；α防御素

0　引言

维生素D（VD）是一种调节钙磷代谢的主要维生素，在免疫以及癌症、疾病感染、组织纤维化、脂肪肝和酒精肝的防治中具有重要作用［1］。大量临床数据表明，维生素D在多种慢性疾病中普遍缺失［1］。维生素D的活性形式为1，25-二羟基维生素D3，通过与维生素D受体（VDR）结合行使功能。VDR是核受体家族的重要转录因子，与特异VDR顺式元件（VD response element，VDRE）结合后，被激活的复合体招募到共激活因子或抑制因子，从而促使或抑制特定基因的转录［2］。

大量研究表明，VD能够影响多种免疫细胞的分化、成熟，抑制Th1反应中IL-2、IL-12和IFN-γ等促炎症因子的表达［3］，诱导T调节细胞的产生［4］，促进Th2反应IL-4、IL-5和IL-10等抑炎症因子的表达［5］。本课题组前期研究表明，在Balb/C小鼠中VDR在皮肤、小肠、肝脏和胰岛中均有表达，尤其在肠道的表达量最高，约为皮肤的20倍，胰腺的100倍，肝脏的1000倍。临床数据和研究发现，VD能够抑制肠道炎症［6］，抑制肠道纤维化［7］和肿瘤［8］的产生和发展，促进肠道上皮细胞紧密连接蛋白的表达［9］，维持肠道潘氏细胞功能［10］等，这些表明肠道是VD作用的重要器官，VD在维持肠道稳态中具有重要作用。

潘氏细胞位于小肠利氏腺窝的基部［11］，在受到胆碱和肠道微生物刺激时，会分泌大量α-防御素（α-defensin，DEFA）及其他抗菌分子和促炎症因子，如溶菌酶、磷脂酶a2、白介素17和肿瘤坏死因子等［11-12］。DEFA是一类由6个高度保守二硫键连接的半胱氨酸骨架阳离子多肽［13］。在小鼠的小肠中，潘氏细胞受到细菌产物刺激时，DEFA在腺窝处的局部浓度可达到25～100mg/mL，是肠道先天免疫的主要成分［14］。在潘氏细胞中，基质金属蛋白酶7（MMP-7）是特异剪切DEFA的酶，DEFA前体N端经MMP-7剪切后，暴露其带有正电荷的活性区域，形成约3.5kD的活性DEFA［15］。研究表明，MMP-7基因敲除小鼠的肠道无法对前体DEFA进行剪切，从而缺乏活性形式的DEFA，使肠道对细菌感染高度敏感，在低剂量的致病菌鼠伤寒沙门氏菌的感染下，MMP-7基因敲除的小鼠与对照组小鼠相比死亡更多、更快［16］。维生素D对肠道的免疫调节非常重要，但其对MMP-7的作用机制仍不清晰。本文检测了维生素D对DEFA活性剪切酶MMP-7的表达调控，从一个新的角度出发探讨维生素D对肠道免疫的调节作用。

1　材料与方法

1.1材料

Caco2细胞由中国科学院细胞库提供，HT29细胞由本实验室保存。DMEM高糖（Hyclone）培养基，含10%胎牛血清 （Clark），1%青霉素-链霉素双抗（Thermo）。1，25-二羟基维生素D3，购于SIGMA公司。杂合子维生素D受体基因敲除小鼠B6.129S4-Vdr＜tm1Mbd＞/J（006133），购于美国Jackson Lab。小鼠饲料：高磷高钙饲料，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。VDR抗体（12550），购于Cell Signaling Technology；MMP-7抗体（sc-8832），购自Santa Cruz Biotechnology；GAPDH抗体购于成都正能生物科技公司；α-defensin 1抗体由南加州大学凯克医学中心Yoshihiro Eriguchi提供。山羊抗兔IgG-HRP（sc-2004），山羊抗小鼠IgG-HRP（sc-2005），和驴抗山羊IgG-HRP（sc-2020）均购于Santa Cruz Biotechnology。通用型山羊抗兔检测试剂盒（PV-6000），山羊二步法超敏检测试剂盒 （PV-9003），DAB检测试剂盒（ZLI9017）均购于北京中杉金桥公司。TRizol试剂购于Transgen公司；反转录试剂盒购于罗氏公司；荧光定量试剂购于Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1VDR基因敲除小鼠的鉴定与饲养

将购于美国Jackson Lab的VDR基因敲除杂合子小鼠雌雄1∶1两两配对进行交配。约3～4周后，雌鼠产下小鼠。待F1代小鼠断奶后（约3周），将其从母鼠处分出至新的笼子内，按雌雄分开。剪取小鼠尾尖约0.5～1cm，提取基因组DNA并进行PCR，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。所使用的引物为Mutant：5′-CACGAGACTAGTGAGACGTG-3′；Wild type：5′-CTCCATCCCCATGTGTCTTT-3′；Common：5′-TTCTTCAGTGGCCAGCTCTT-3′。凝胶显影后，只有一条500bp大小条带的为VDR基因敲除纯合子，有两条分别为382bp和500bp条带的为杂合子，只有一条382bp大小的条带为野生型小鼠。所有小鼠均饲养在独立通气笼具（IVC）系统中，25℃恒温，12h昼夜交替饲养，小鼠饲料和饮水供给充足，动物饲养与实验完全遵守美国国立卫生研究院（NIH）颁布的实验动物管理使用条例的规定。

1.2.2免疫组织化学染色

将新鲜的小鼠回肠取出，从前段剪取约1cm长度，用4%多聚甲醛4℃固定24～48h，酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋、切片。将野生型和VDR基因敲除小鼠的回肠切片置于二甲苯中脱蜡两次，每次10min，然后分别置于100%，95%，75%酒精各5min，流水冲洗；将回肠切片置于抗原修复液中，煮沸15～20min。根据所检测抗原等电点的不同，检测VDR、MMP-7时使用柠檬酸缓冲液（pH 6.0），检测DEFA1时使用Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）；然后用3%双氧水处理10min，水洗，0.3%Triton X-100穿孔10min，PBS洗3次，每次5min；3%BSA室温封闭1h，根据抗体使用说明配置一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次；二抗室温孵育1 h，PBS洗3次；DAB显色，置于显微镜下观察显色程度，水洗终止显色；苏木精复染，水洗，酒精梯度脱水，干燥后用中性树脂封片，倒置显微镜明场拍照检测。

1.2.3细胞培养与处理

Caco2细胞和HT29细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基于5%CO2，37℃培养箱中培养。将细胞按照5×105接种于六孔板中，待细胞至60%～70%汇合度时，更换为无血清DMEM培养基，血清饥饿12h；然后吸去培养基，更换为含1%胎牛血清的DMEM培养基，实验组加入100nmol/L的1，25-二羟基维生素D3、对照组加入相同体积的乙醇作为阴性对照，处理24h。收集细胞，提取RNA或蛋白质，进行后续qRT-PCR和Western blot检测。

1.2.4qRT-PCR检测MMP-7基因的表达

在收集的细胞或组织样本中加入TRizol，按照说明书步骤进行RNA提取，随后立即取1g总RNA按照罗氏的反转录试剂盒进行反转录，将所得的cDNA稀释5倍后，作为模板，利用荧光定量试剂进行qPCR，检测MMP-7的表达。待测基因引物序列如下：人CYP24al上游引物：5′-CGACTACCGC AAAGAAGGCTA-3′，下游引物：5′-ACCATTTGTTCA GTTCGCTGT-3′；人MMP-7上游引物：5′-GTTTAGA AGCCAAACTCAAGG-3′，下游引物：5′-CTTTGACA CTAATCGATCCAC-3′；人GAPDH上游引物：5′-CC TGGAGAAACCTGCCAAGTAT-3′，下游引物：5′-CTC GGCCGCCTGCTT-3′。小鼠MMP-7上游引物：5′-GCAGAAGTTCTTTGGCCTGC-3′，下游引物：5′-TA TCCGCAGTCCCCCAACTA-3′；小鼠RPL-19上游引物：5′-GAAGGTCAAAGGGAATGTGTTCA-3′，下游引物：5′-CCTTGTCTGCCTTCAGCTTGT-3′。qRTPCR反应体系为20.0 μL，反应条件：95℃预变性30 s，95℃ 10s，60℃ 30 s，总共40个循环，采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。实验重复3次。

1.2.5Western blot检测蛋白表达

细胞总蛋白提取：将细胞培养基弃尽，用预冷的1×PBS漂洗2～3次，用细胞刮将细胞尽数刮下，4℃800g离心10min收集细胞。弃尽PBS后加入适量的RIPA（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8；150 mmol/L NaCl；1.0%Triton X-100；0.1%SDS；PMSF 1mmol/L）裂解液于冰上，每10 min涡旋震荡30 s，30 min后，4℃最大转速离心30min，吸取上清，即细胞总蛋白。所得蛋白用BCA法测得浓度，随后加入5×SDSPAGE上样缓冲液，于金属浴中100℃加热10min。然后将制得的蛋白样品于12%的SDS-PAGE进行电泳，4℃转于PVDF膜上，5%的脱脂牛奶室温封闭1h，一抗4℃孵育过夜，PBST洗3次，每次10 min；二抗室温孵育1 h，PBST洗3次，ECL显影成像。

2　结果

2.1DEFA1在VDR-KO小鼠的回肠中表达量降低

VDR基因敲除（VDR-KO）小鼠通过基因打靶技术，在VDR基因第2个外显子内插入一段序列，使VDR基因不能正常翻译表达［17］。亲代杂合子小鼠交配后，通过PCR检测子代小鼠的基因型（见图1），分别鉴定出VDR-KO小鼠（VDR-/-）、杂合子小鼠（VDR+/-）和野生型（WT）小鼠（VDR+/+）。

图1　子代小鼠基因型鉴定

免疫组化染色表明，VDR-KO小鼠的回肠中无阳性着色区域（见图2），而WT小鼠回肠内VDR主要分布在肠腺窝和绒毛中，并且VDR主要分布于细胞核。为了研究VDR对肠道防御素DEFA1的影响，利用免疫组化染色，在WT小鼠和VDR-KO小鼠中检测了DEFA1的表达情况。如图2所示，VDR-KO小鼠回肠腺窝底部的DEFA1表达量较WT小鼠显著降低。

2.2DEFA1的活性剪切酶MMP-7在VDR-KO

小鼠中表达降低

在小鼠的肠道中，DEFA的成熟、活化及分泌主要由MMP-7介导［15］。在VDR-KO小鼠中DEFA1的下调可能是由其剪切酶MMP-7的下调引起的。因此利用免疫组化染色和qRT-PCR发现，与WT小鼠相比，VDR-KO小鼠回肠中MMP-7蛋白与mRNA表达量降低，并且具有显著差异（见图3）。初步表明，在VDR-KO小鼠中，MMP-7的表达量降低，造成MMP-7对DEFA1的剪切作用减弱，使得DEFA1的表达量下调。

2.31，25-二羟基维生素D3在肠道细胞系中上调MMP-7

为了验证VD-VDR能够调控MMP-7的表达，选取两株人肠道细胞系进行体外实验。通过qRTPCR检测发现，经过100 nmol/L 1，25（OH）2VD3处理后，VDR下游的靶基因CYP24al表达量显著增加，在Caco2细胞中约增加2000倍，HT29细胞中约增加300倍（见图4（a））。同时1，25（OH）2VD3处理后，MMP-7的mRNA表达量于Caco2细胞和HT29细胞中均显著上调（见图4（b））。此外，利用Westernblot检测发现，VDR和MMP-7的蛋白水平显著上调（见图4（c）），初步表明1，25（OH）2VD3通过上调VDR，进而上调MMP-7的表达。

图2　DEFA1在VDR基因敲除小鼠回肠中的表达量降低

图3　MMP-7在VDR基因敲除小鼠回肠中的表达

3　讨论

在前期的实验中发现，饮食缺乏VD的小鼠和VDR-KO小鼠肠道存在慢性炎症，并且肠道菌群的组成也发生显著变化。推测这种改变与肠道防御素的下调相关。肠道防御素对肠道表皮干细胞具有保护作用，可以防止多种有害菌定殖在腺窝处［18］。小肠腺窝处的防御素含量约有毫克级，而防御素在微克级便可发挥其抗菌活性，所以这些防御素足以有效保护腺窝［19］。小肠中的微生物含量与结肠微生物的比例约为1∶104到1∶106，防御素给小肠提供了一个抗菌的环境，使得临近大肠的菌群没有过多的定殖到小肠中［20］。由于对防御素的敏感性不同，肠道菌群中各种菌的相对丰度有所差异，所以肠道菌的分布与菌群构成部分受到防御素的支配［21］。防御素还具有旁路信号分子作用，如小鼠的隐窝素3，可引起盐和水的分泌反应［22］，还可以诱导白介素8（IL-8）的分泌［23］。在之前的实验中发现，小鼠灌胃α-防御素5 （DEFA5）后，可以重新平衡饮食介导的VD缺失小鼠肠道菌群。

图4　1，25-二羟基维生素D3在肠道细胞系中上调MMP-7

研究证明维生素D可以直接诱导防御素的表达［24］，如人的β防御素2、3和4，在其启动子上具有VDR顺式元件（VDRE）［25］。然而单纯的VD并不能够明显诱导其表达，需要NF-B通路的共同作用［26］。在实验中发现，VD并不能明显的诱导DEFA的表达，而更多的是通过调控MMP-7从而调控活性形式的DEFA表达量。在人体中，与小鼠防御素直系同源人的防御素前体主要是由胰蛋白酶的异构体剪切［14］。而通过实验结果推测，在人体中MMP-7也同样能够剪切DEFA介导其成熟。此外，MMP-7作为一种基质金属蛋白酶，其在多种外分泌和粘膜表皮中表达，如皮肤，唾液腺，胰腺，肝脏，乳腺，肠道，泌尿生殖道和肺等［27］，其底物包括一些细胞外基质组分如纤连蛋白、明胶、IV型胶原、层黏连蛋白和弹力蛋白等。MMP-7对它们的剪切导致基质分解，这对细胞的迁移和组织的重构十分重要［27］。研究表明，在组织损伤、修复过程中，MMP-7通过剪切趋化因子CXCL1抑制炎症反应［28］，剪切E-cadherin等细胞粘附蛋白促进伤口边缘细胞迁移［29］，从而促进伤口修复。因此，研究结果也暗示了VD可能通过调控MMP-7从而促进组织损伤修复。通过生物信息学分析，我们发现在MMP-7基因的启动子区域-1285位和-1006位，存在VDR结合作用元件——VDRE序列。因此推测，维生素D可能是通过VDR/VDRE作用于MMP-7的启动子，在转录水平上调控MMP-7的表达，因此需要进一步实验证明。

4　结束语

VD在肠道免疫中具有重要的作用，本文发现通过诱导MMP-7的表达可增加肠道免疫成分DEFA的表达量，从而调节肠道菌群，这为以后肠道菌群以及肠道免疫相关疾病的治疗提供了新的思路。

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（编辑：莫婕）

1，25（OH）2VD3up regulates activation of α-defensins through induction of MMP-7 in mouse intestine

CHEN Zishuo，LIU Yu
（College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

The aim of this study was to find the role of VD in regulating the active form of αdefensin 1（DEFA1），one of the antibacterial peptides in mouse intestine.It showed that the active DEFA1 was much lower in VDR knock-out mice compared to the wild type（WT）mice. Both mRNA and protein of matrix metalloproteinase-7（MMP-7），the cleaved enzyme of DEFA1，as detected by immumohistochemical staining and qRT-PCR，were at a relatively low level.In vitro experiment showed that VD can induce the expression of MMP-7 in colon cells.Thus，it suggested that VD can regulate the expression of MMP-7.When VD was deficient，MMP-7 was down-regulated and so was the active form of DEFA1，it might lead to impairment of intestinal innate immunity and dysbiosis and drive chronic disorders.

1，25（OH）2VD3；Vitamin D receptor knock-out mice；matrix metalloproteinase-7；αdefensin

A

1674-5124（2016）08-0057-07

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.08.012

2016-03-20；

2016-04-25

陈子硕（1990-），女，江苏徐州市人，硕士研究生，专业方向为代谢综合征、肠道菌群细胞生物学。