斑马鱼血栓模型的建立与冠心宁片的干预作用

王木兰，潘永明，金敏，徐孝平，王德军，马全鑫，陈民利*

(1.正大青春宝药业有限公司，杭州 310023；2. 浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州310053)



斑马鱼血栓模型的建立与冠心宁片的干预作用

王木兰1，潘永明2，金敏1，徐孝平2，王德军2，马全鑫2，陈民利2*

(1.正大青春宝药业有限公司，杭州 310023；2. 浙江中医药大学动物实验研究中心，杭州310053)

目的采用3种诱导剂分别建立斑马鱼血栓模型，观察冠心宁片的抗血栓作用。方法分别采用1.5μmol/L苯肼、80μmol/L花生四烯酸和5mg/L普纳替尼建立活体斑马鱼血栓模型，并用冠心宁片、氯吡格雷或阿司匹林等药物干预，观察尾静脉血栓形成情况，并用邻联茴香胺染色法对心脏红细胞染色强度进行定量分析，计算预防血栓药效。结果苯肼、花生四烯酸和普纳替尼诱导后斑马鱼尾静脉血栓明显增加和心脏红细胞染色强度显著降低(P<0.001)，同时冠心宁片均能显著对抗这三种模型的血栓形成，其心脏红细胞染色强度和预防血栓药效均明显增加(P<0.001)，具有一定的剂量效应关系，IC50分别为44.32、138.5和459.5mg/L。结论苯肼、花生四烯酸和普纳替尼均能建立不同形成机理的斑马鱼血栓模型，而冠心宁片具有明显的抗血栓作用，且其抗血栓机制存在多靶点效应。

冠心宁片；血栓模型；斑马鱼；抗栓作用

急性血栓栓塞性疾病仍然是引起死亡或致残的主要原因。动物模型常被用来了解病理过程包括血栓的形成机制以及抗血栓药物的有效性和安全性评价。斑马鱼作为一种研究人类疾病理想的新型模式动物，具有许多独特的优势[1]，如斑马鱼与人类一样具有遗传保守性，存在70%的人类同源基因[2]，以及拥有凝血因子、血小板受体，并对临床应用的抗凝血和抗血栓药物具有很好的反应[3-4]，适合于血栓形成机制和治疗药物的评价。故斑马鱼作为新型模式动物逐渐受到国内研究者的青睐，被广泛用于生理毒理、药理和肿瘤等研究中。近来有学者用苯肼诱导建立斑马鱼血栓模型[5]，但血栓形成机制十分复杂，涉及氧化应激、花生四烯酸代谢途径、血管内皮生长因子受体调控等，且其发生发展受凝血、纤溶系统、前列腺素、血小板等方面的影响，因此，从不同层次、环节和研究手段来阐明血栓形成的发展机理并寻找有效治疗药物成为当前研究的热点。近来认为，活血化瘀是中医抗血栓的治则。冠心宁片(GXN)是由活血化瘀中药川芎和丹参经改进提取工艺而制成的一个新制剂，用于治疗冠心病、心绞痛(胸痹心痛)。本课题组前期发现冠心宁片能明显升高急性心肌缺血犬血清一氧化氮(NO)水平，增加冠脉流量；并能降低气滞血瘀大鼠血小板聚集和改善血液粘聚性，通过改变血小板花生四烯酸代谢途径，改善血栓素B2(TXB2)/6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的平衡，保护血管内皮的作用[6-7]，提示冠心宁片可能有抗血栓形成的作用。为此，本文利用不同诱导剂苯肼(phenylhydrazine,PH)、花生四烯酸(arachidonicacid,AA)、普纳替尼(ponatinib)建立活体斑马鱼血栓模型并初步探讨其可能的形成机制，同时观察冠心宁片抗血栓的作用，为冠心宁片用于临床的应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

实验所用斑马鱼为健康AB系和Albino系野生型斑马鱼，参照Westerfield[8]的养殖方法，饲养于杭州环特生物科技有限公司斑马鱼实验室[SYXK(浙)2012-0171]。在28℃条件下用养鱼用水孵育胚胎，胚胎可以从自身的卵黄囊中获取营养物质，故在受精后9d内(9dayspostfertilization,dpf)无需喂食。实验完成后用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求。

1.2试验药物与仪器试剂

冠心宁片(冠心宁浸膏，GXN)，正大青春宝药业有限公司；氯吡格雷(clopidogrel)，上海晶纯实业有限公司；阿司匹林(aspirin)，上海晶纯实业有限公司；苯肼，阿拉丁；花生四烯酸，上海船夫生物科技有限公司；普纳替尼(ponatinib)，MedChemExpress公司。临用前冠心宁浸膏粉用0.9 %生理盐水配成20g/L的母液，苯肼用100%乙醇配成1.5mmol/L母液；花生四烯酸、阿司匹林、氯吡格雷和普纳替尼用100% 二甲基亚砜(DMSO)助溶分别配成8mmol/L、45g/L、7.5g/L和5g/L母液，备用。SZX7型解剖显微镜，日本Olympus公司；TK-C1481EC高清摄像机，日本凯勒电子公司；6孔板，上海NestBiotech公司。

1.3方法

1.3.1苯肼诱发斑马鱼血栓模型的建立及药物干预

AB系斑马鱼胚胎发育至2d时，在解剖显微镜挑选发育正常的胚胎，将其分到微孔板中，设置8个实验组：即正常对照组(NC)、模型组(用1.5μmol/L苯肼处理，PHmodel)、冠心宁片干预组：分别将终浓度为12.5、25、50、100和200mg/L的冠心宁片预处理6h后加入诱导剂1.5μmol/L苯肼；氯吡格雷组：终浓度7.5mg/L氯吡格雷预处理6h后加入诱导剂1.5μmol/L苯肼。每组30尾，之后28℃恒温培养箱培养24h。

1.3.2花生四烯酸诱发斑马鱼血栓模型的建立及药物干预

Albino系斑马鱼胚胎发育至3d时，在解剖显微镜挑选发育正常的胚胎，将其分到微孔板中，设置8个实验组：即正常对照组(NC)、模型组(用80μmol/L花生四烯酸处理，AAmodel)、冠心宁片干预组：分别将终浓度为75、150、300、600和1200mg/L的冠心宁片预处理6h后加入诱导剂80μmol/L花生四烯酸；阿司匹林组：终浓度22.5mg/L阿司匹林预处理6h后加入诱导剂80μmol/L花生四烯酸。每组30尾，之后28℃恒温培养箱培养1.5h。

1.3.3普纳替尼诱发斑马鱼血栓模型的建立及药物干预

Albino系斑马鱼胚胎发育至5d时，在解剖显微镜挑选发育正常的胚胎，将其分到微孔板中，设置8个实验组：即正常对照组(NC)、模型组(用5mg/L普纳替尼处理，ponatinibmodelgroup)、冠心宁片干预组：分别将终浓度为150、300、600、1200和1500mg/L的冠心宁片与诱导剂5mg/L普纳替尼共处理18h；阿司匹林组：终浓度45mg/L阿司匹林与诱导剂5mg/L普纳替尼共处理18h。每组30尾，之后28℃恒温培养箱培养18h。

1.4观察指标

分别经苯肼处理24h、花生四烯酸处理1.5h、普纳替尼处理18h后，用1g/L邻联茴香胺染液对斑马鱼染色30min；然后，每组随机挑选20尾斑马鱼在显微镜下观察尾静脉血栓情况并拍照，照片拍摄放大倍数为56倍；用NIS-ElementsDTM图像处理软件进行定量分析心脏红细胞染色强度(SI)，并计算预防血栓药效 (%)=[SI(药物干预组)-SI(模型组)]/SI(正常对照组)-SI(模型组) × 100%和半数抑制浓度IC50。

1.5统计学处理

2　结果

2.1苯肼诱导斑马鱼血栓模型的建立及药物干预

与正常对照组比，PH模型组尾静脉血栓明显增加而心脏红细胞染色强度(SI)明显减少(P<0.001)，提示建模成功；与PH模型组比，7.5mg/L氯吡格雷干预后尾静脉血栓减少明显，并能显著增加SI(P<0.001)，预防血栓效率达43.79%；同时，12.5、25、50、100和200mg/L的冠心宁片干预后SI亦有不同程度的增加，其中25～200mg/L剂量组的作用显著(P<0.01, P<0.001)，各剂量组预防血栓效率分别为24.32%、37.63%、65.02%、93.90%和95.16%，具有一定的剂量效应关系，IC50为44.32mg/L，同时200mg/L冠心宁片也能显著减少尾静脉血栓。见图1、2。

注：与正常对照组比，ΔΔΔP<0.001; 与PH模型组比, **P< 0.01, ***P< 0.001. 正常对照组，苯肼模型组，7.5 mg/L氯匹格雷组， 12.5 mg/L、 25 mg/L、 50 mg/L、 100 mg/L和 200 mg/L冠心宁片组。图1　苯肼诱导斑马鱼血栓模型的建立及药物干预 (n =20)Note. Compared with the NC group,ΔΔΔP<0.01; Compared with the PH model group, **P< 0.01, ***P< 0.001.NC group, PH model group, 7.5 mg/L Clopidogrel group,12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L and200 mg/L GXN group.Fig.1　Establishment of thrombosis model induced by phenyl hydrazine in the zebrafish and drug intervention of the models

注：图A1-A8分别为正常对照组，苯肼模型组，7.5 mg/L氯吡格雷组，12.5、25、50、100和200 mg/L冠心宁片组；图B1-B4分别为正常对照组，苯肼模型组，7.5 mg/L氯吡格雷组和200 mg/L冠心宁片组。图2　各组心脏红细胞染色(A)和尾静脉血栓(B)的变化Note. Figure A1-A8: NC group, phenyl hydrazine model group, 7.5 mg/L Clopidogrel group, GXN groups in a dose of 12.5, 25, 50, 100 mg/L, and 200 mg/L, respectively. Figure B1-B4: NC group, phenyl hydrazine model group, 7.5 mg/L Clopidogrel group and 200 mg/L GXN group, respectively.Fig.2　Changes of cardiac red blood cells stained with O-dianisidine and venous thrombus in the zebrafish

2.2花生四烯酸诱导斑马鱼血栓模型的建立及药物干预

与正常对照组比，AA模型组尾静脉血栓生成明显增加，同时心脏红细胞染色强度(SI)明显减少(P<0.001)，提示建模成功；与模型组比，22.5mg/L阿司匹林干预后能明显减少尾静脉血栓和显著增加SI(P<0.001)，预防血栓效率达69.17 %；且75、150、300、600和1200mg/L的冠心宁片干预后SI亦有不同程度增加，其中150～1200mg/L剂量组的作用显著(P<0.01, P<0.001)，各剂量组的预防血栓效率分别为9.83 %、29.83 %、53.01 %、61.63 %和71.40 %，有一定的剂量效应关系，IC50为138.5mg/L，同时1200mg/L冠心宁片也能显著减少尾静脉血栓，见图3、4。

注：图A1-A8分别为正常对照组，花生四烯酸模型组，22.5 mg/L阿司匹林组，75、150、300、600和1200 mg/L冠心宁片组；图B1-B4分别为正常对照组，花生四烯酸模型组，22.5 mg/L阿司匹林组和1200mg/L冠心宁片组。图4　各组心脏红细胞染色(A)和尾静脉血栓(B)的变化Note. Figure A1-A8: NC group, Arachidonic acid model group, 22.5 mg/L Aspirin group, GXN groups in a dose of 75,150, 300,600 mg/L, and 1200 mg/L, respectively. Figure B1-B4: NC group, Arachidonic acid model group, 22.5 mg/L Aspirin group and 1200 mg/L GXN group, respectively.Fig.4　Changes of the O-dianisidine staining intensity of erythrocytes in the heart and venous thrombus in the zebrafish

2.3普纳替尼诱导斑马鱼血栓模型的建立及药物干预

注：与正常对照组比，ΔΔΔP<0.001; 与ponatinib模型组比, **P< 0.01, ***P< 0.001. 正常对照组，普纳替尼模型组，45 mg/mL阿司匹林组，150 mg/L、300 mg/L、600 mg/L、1200 mg/L和1500 mg/L冠心宁片组。图5　普纳替尼诱发活体斑马鱼血栓模型的建立及药物干预 (n =20)Note. Compared with the NC group,ΔΔΔP<0.01; Compared with the ponatinib model group, **P< 0.01, ***P< 0.001. NC group, Ponatinib model group, 45 mg/mL Aspirin group, 150 mg/L, 300 mg/L, 600 mg/L, 1200 mg/L and1500 mg/L GXN group.Fig.5　Establishment of the thrombosis model induced by ponatinib in the zebrafish and drug intervention

与正常对照组比，Ponatinib模型组尾静脉血栓生成明显增加而心脏红细胞染色强度(SI)明显减少(P<0.001)，提示建模成功；与模型组比，45mg/L阿司匹林干预后能减少尾静脉血栓并能显著增加SI(P<0.001)，预防血栓效率达66.36%；同时，剂量为150、300、600、1200和1500mg/L的冠心宁片干预后SI也有不同程度的增加，其中600～1500mg/L剂量组的作用显著(P<0.001)，各剂量组的预防血栓效率分别为5.33 %、9.91 %、85.84 %、89.93 %和107.73%；IC50为459.5mg/L，同时1500mg/L冠心宁片也能显著减少尾静脉血栓，见图5，6。

注：图A1-A8分别为正常对照组，普纳替尼模型组，45 mg/mL阿司匹林组，150、300、600、1200和1500 mg/L冠心宁片组；图B1-B4分别为正常对照组，普纳替尼模型组，45 mg/mL阿司匹林组和1500mg/L冠心宁片组。图6　各组心脏红细胞染色(A)和尾静脉血栓(B)的变化Note. Figure A1-A8: NC group, Ponatinib model group, 45 mg/L Aspirin group, GXN groups with 150, 300,600,1200 mg/L, and 1500 mg/L, respectively. Figure B1-B4: NC group, Ponatinib model group, 45 mg/L aspirin group and 1500 mg/L GXN group, respectively.Fig.6　Changes of the O-dianisidine staining intensity of erythrocytes in the heart and venous thrombus in the zebrafish

3　讨论

血栓形成是多因素参与、渐进发展的复杂过程，血液在流动状态下因血小板的活化和凝血因子被激活而发生的异常凝固[9]。血栓形成在心脑血管疾病的发生与发展中起促进作用，也是引起死亡和致残的主要原因之一。血栓形成的条件包括血管内膜损伤、血流状态的改变和血液凝固性增加。因此，抑制血小板功能和防止血液凝固可预防血栓形成。临床上应用的抗血小板和抗凝血酶药物较多，如血小板环氧化酶抑制剂阿司匹林、血小板内环核苷酸抑制剂双嘧达莫、二磷酸腺苷(ADP)受体拮抗剂氯匹格雷、抗凝血酶Ш(ATШ)的肝素、维生素K拮抗剂华法林等，这些药物共同的特点是单药、单靶点、且不可逆的抑制，导致不良反应时有发生，如阿司匹林能引起患者过敏、胃肠道反应、瑞氏综合征、肝损害、凝血障碍等[10]；也有发现部分患者存在阿司匹林和氯吡格雷抵抗或反应性低的现象，甚至对这两药存在同时抵抗，导致术后血栓形成的并发症明显增加[11]。因此，寻找多靶点、多通路且疗效显著、安全性高的抗血栓药物具有重要意义；而建立理想的血栓模型是研究人类疾病机理和药物防治重要的研究手段之一。

苯肼是一种强氧化剂，能作用于机体后引起自由基产生，促进红细胞膜骨架和珠蛋白的氧化，使得红细胞内的抗氧化系统失衡，加速膜脂质过氧化，最终红细胞变形能力降低并使其易于黏附到细胞外基质中，进而损伤血管内膜，促进血小板黏附、聚集和血管活性物质的大量释放，导致血栓形成[5,12]。本研究显示，苯肼诱导后斑马鱼的心脏红细胞染色强度明显减少和尾静脉血栓明显增加，这与张勇等[5]研究结果一致，并发现斑马鱼红细胞染色强度与尾静脉血栓长度呈明显负相关，故可用红细胞染色强度评估血栓生成情况。用氯吡格雷干预后能明显减轻其血栓率，证实苯肼能诱导活体斑马鱼血栓形成，其形成机制与苯肼引起红细胞抗氧化系统失衡，自由基生成过多和脂质过氧化反应增加，促进血管内皮损伤和血小板聚集，导致血栓形成有关。冠心宁片是由丹参和川芎两味中药组成，且这两味药均有活血化瘀的疗效，在临床上被广泛用于治疗冠心病心绞痛。前期已证实冠心宁片具有抗自由基作用[13]。同样，冠心宁片能显著对抗苯肼诱导斑马鱼的血栓形成，具有一定的剂量效应关系，表明冠心宁片有抗血栓形成作用，其效应与对抗自由基生成，抑制脂质过氧化反应和血小板聚集有关[7,13]。

花生四烯酸可诱导血小板释放内源性ADP，激活血小板聚集，这是血小板聚集的主要途径之一；并且花生四烯酸通过环氧合酶和脂氧酶的作用，产生血栓素、前列腺素和白三烯等，其代谢产物血栓素TXA2具有收缩血管、促进血小板聚集，增加血液粘滞性的作用，同时前列腺素具有扩张血管和抑制血小板聚集的作用，两者共同调节血小板的聚集和血管收缩程度，维持血管的正常张力和血液循环通畅[14]。本研究结果表明花生四烯酸能引起斑马鱼心脏红细胞染色强度降低和尾静脉血栓明显增加，用环氧化酶抑制剂阿司匹林干预后血栓形成减少明显，故花生四烯酸也可诱导活体斑马鱼血栓形成，其机制与花生四烯酸代谢途径有关。而给予冠心宁片干预后也能明显对抗花生四烯酸诱导斑马鱼血栓形成，提示冠心宁片抗血栓作用也可能影响花生四烯酸代谢途径有关。

普纳替尼是一种多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗急慢性淋巴细胞白血病，但在临床应用后发现患者出现严重的血栓和血管狭窄等副作用而受监控。近来发现普纳替尼导致血栓形成与抑制血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成，影响NO合成，导致血管内皮损伤，诱发血栓形成有关[15]，并有学者发现普纳替尼内有血管内皮生长因子受体(VEGFR)[16]，可阻断PI3K/AKT/eNOS通路的传递。令狐克刚等[17]发现阿司匹林对氧化低密度脂蛋白诱导的人主动脉内皮细胞损伤有保护作用，与其调控激活p-Akt/eNOS信号通路密切相关。本研究也发现普纳替尼诱导后斑马鱼能形成明显的血栓，并用阿司匹林干预后能抑制血栓的形成，提示普纳替尼所致斑马鱼血栓形成可能与PI3K/AKT/eNOS通路表达调控异常有关。另外，冠心宁片干预后同样能明显对抗普纳替尼诱导斑马鱼血栓的形成，该效应可能与其能提高NO水平和保护血管内皮损伤有关，但是否与PI3K/AKT/eNOS通路表达调控有关，还有待于进一步研究。

由此可见，苯肼、花生四烯酸和普纳替尼均能建立活体斑马鱼血栓模型，并能快速、简便、直观的观察血栓形成和溶栓情况，但血栓形成机制可能有所差异，如苯肼诱导可能与自由基生成有关，花生四烯酸诱导可能与花生四烯酸代谢途径有关，而普纳替尼诱导可能与PI3K/AKT/eNOS通路表达调控异常有关，故这些斑马鱼血栓模型对加快筛选抗栓药物并了解其作用特点具有支撑作用。此外，通过对冠心宁片、氯吡格雷和阿司匹林药物的干预也进一步证实了斑马鱼模型的敏感性和有效性；进而也证实冠心宁片具有抗血栓作用，且其抗血栓机制存在多靶点效应。

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Establishment of a zebrafish model of thrombosis and theinterventioneffectofGuanxinningtablet

WANGMu-lan1,PANYong-ming2,JINMin1,XUXiao-ping2,WANGDe-jun2,MAQuan-xin2,CHENMin-li2*

(1.ZhengdaQingchunbaoPharmaceuticalCo.,Ltd.Hangzhou310023;2.LaboratoryAnimalResearchCenter,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

ObjectiveToestablishazebrafishmodelofthrombosisinducedbythreekindsofinducersandobservetheanti-thromboticeffectofaChinesetraditionalmedicine,Guanxinningtablet(GXN).MethodsThezebrafishmodelsofthrombosiswasinducedbyusing1.5μmol/Lphenylhydrazine, 80μmol/Larachidonicacidand5mg/Lponatinib,respectively,andweretreatedwithvariousconcentrationofGXN,clopidogrelorasprin.Thethrombusinthetailveinwasobservedundermicroscope,Erythrocytesinthezebrafishheartwerestainedwitho-dianisidineandtheerythrocytestainingintensitywasassessedwithaNIS-ElementsDTMimageanalyzer,andtheanti-thromboliceffectofGXNwascalculated.ResultsVenousthrombuswassignificantlyincreasedandthestainingintensitiesoferythrocytesintheheartweresignificantlydecreasedafterinductionbyphenylhydrazine,arachidonicacidorPonatinib(P<0.001),respectively.Atthesametime,GXNshowedanincresinganti-thromboliceffectinthezebrafishmodels(P<0.001)inadose-effectmanner,withaIC50ofGXNof44.32mg/L,138.5mg/Land459.5mg/L,respectively.ConclusionsThezebrafishmodelsofthrombosisaresuccessfullyestablishedbyphenylhydrazine,arachidonicacidorPonatinib,respectively,bydifferentformationmechanisms.GXNhasbeenshowntohaveananti-thrombosiseffect,probably,bymultipletargeteffects.

Guanxinningtablet;Thrombosismodel;Zebrafish;Anti-thromboticeffect;Phenylhydrazine;Arachidonicacid;Ponatinib

CHENMin-li.E-mail:cmli991@aliyun.com

浙江中医药大学比较医学创新团队(XTD201301)。

王木兰(1983-)，女，工程师，研究方向为中药药理。E-mail:qcbwml@163.com

陈民利(1963-)，女，教授，研究方向为实验动物与比较医学。E-mail:cmli991@aliyun.com

研究报告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0432-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.018

2016-05-10