肝癌大鼠瘤组织中Bsep基因的表达变化

王洁萍，张孟瑜，李波，夏先明（泸州医学院附属医院，四川泸州646000）

·基础研究·

肝癌大鼠瘤组织中Bsep基因的表达变化

王洁萍，张孟瑜，李波，夏先明
（泸州医学院附属医院，四川泸州646000）

目的 观察肝癌大鼠瘤组织中胆盐输出泵（Bsep）基因的表达变化。方法 取Wistar大鼠70只，随机分为观察组与对照组各35只，对照组予普通饮食，观察组予二乙基亚硝胺饮食。20周后观察组死亡2只，对照组未出现死亡病例。经病理检查证实观察组肝癌模型建立成功，建模成功大鼠胆管内发现数量不等的泥沙样结石。取对照组肝脏组织和观察组肝脏肿瘤组织，采用自动生化仪检测两组胆管内胆汁中胆固醇（TC）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）。采用实时荧光定量PCR法检测对照组肝脏组织和观察组肝脏肿瘤组织中Bsep基因表达强度。石蜡切片后用免疫组化SP法检测对照组肝脏组织和观察组肝脏肿瘤组织中Bsep蛋白表达强度。结果 观察组胆汁中TBA、TC、DBIL水平明显高于对照组（P均＜0.05），对照组、观察组Bsep基因相对表达量分别为8±0.5、31±1.3，两组比较，P＜0.05；对照组、观察组肝脏组织中Bsep蛋白表达阳性率分别为68.2%、17.5%，两组比较，P＜0.05。结论 肝癌大鼠肝脏肿瘤组织中Bsep基因表达明显减少。

肝肿瘤；胆盐输出泵基因；大鼠

近年来，肝癌发病率逐渐增加，首选手术切除，但部分无法行根治性切除的患者仅能行姑息性切除，5年生存率较低。对无法进行手术或放弃手术的患者，包括存在身体各器官严重功能障碍，肿瘤侵及周围组织或远处转移者，因自身条件有限放弃手术者等，进行放疗、化疗、射频消融等非手术治疗后发现效果有限。基因治疗是目前研究的热点，胆盐输出泵（Bsep）基因与胆汁酸分泌关系密切［1］，如Bsep功能紊乱，则可能引起胆汁酸淤积；而胆汁酸如果淤积，则可能形成结石，进而可能导致肝脏组织的恶变。2015年1～8月，我们观察了Bsep基因在肝癌大鼠瘤组织中的表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠70只，体质量（160±8）g，由泸州医学院动物实验中心提供。主要试剂包括Real-time PCR定量试剂盒、Bsep单克隆抗体等。主要仪器包括ABI7500实时荧光定量PCR仪，冰冻切片机，HFsafe生物安全柜，显微摄像系统（PM-10A）等。

1.2 肝癌模型制备及分组 将雄性Wistar大鼠随机分为对照组与观察组各35只，对照组予以普通饮食，实验组予以含二乙基亚硝胺（DEN）饮食，连续20周后观察组改为自由进食，对照组自由饮水及进食。每天观察大鼠的精神状态、饮食状况及皮毛的变化等。于实验第8、16、20周，分别取出模型组动物各2只，剖腹观察肝脏情况，记录肝脏的形态质地等变化，20周后观察组死亡2只。对照组大鼠饮食及生长较好，未出现死亡病例。经病理检查证实观察组肝癌模型建立成功，均为肝细胞性肝癌，肿瘤组织主要集中在右肝，约18.5%大鼠左肝部分组织亦出现肿瘤。

1.3 胆管内胆汁中胆固醇（TC）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）测定 采用头皮针插入胆管内提取胆汁0.8～1 mL。采用自动生化仪检测两组胆管内胆汁中TC、TBA、TBIL、DBIL。

1.4 Bsep基因表达检测 取对照组肝脏组织和观察组肝脏肿瘤组织，采用实时荧光定量PCR法检测肝脏组织和肝脏肿瘤组织中Bsep基因表达强度。肝脏组织及肝脏肿瘤组织中RNA的提取参照TRIzol试剂说明书进行操作。序列扩增机器为ABI7500，以GAPDH为内参照。设计Bsep上游引物5′-CCCTCAACTGATGGGGGCTCCAGT-3′，下游引物3′-CCCATGTCTGACTCAGTGATTCTT-5′；GAPDH上游引物5′-GATGGTGGGTATGGGTCAGAA-3′，下游引物3′-CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-5′。使用2-ΔΔCt表示Bsep基因相对表达量。

1.5 Bsep蛋白表达检测 石蜡切片后用免疫组化SP法检测肝脏组织和肝脏肿瘤组织中Bsep蛋白表达强度。肝脏组织及肝脏肿瘤组织中Bsep蛋白出现黄色染色颗粒为阳性细胞。每张切片随机选取6个视野，每个视野内观察80个细胞，阳性细胞≥10%为阳性，否则为阴性。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量数据用±s表示，组间比较采用t检验及χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胆管内胆汁中TC、TBA、TBIL、DBIL水平比较 见表1。建模成功大鼠胆管内发现数量不等的泥沙样结石。

表1 两组胆管内胆汁中TC、TBA、TBIL、DBIL水平比较（±s）

表1 两组胆管内胆汁中TC、TBA、TBIL、DBIL水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别nTC（mmol/L）TBA（μmol/L）TBIL（μmol/L）DBIL（μmol/L）观察组355.87±0.13*4.57±0.06*3.80±0.031.82±0.03*对照组352.38±0.111.65±0.033.73±0.050.58±0.05

2.2 两组Bsep基因表达比较 观察组与对照组Bsep基因相对表达量分别为8±0.5、31±1.3，两组比较，P＜0.05（t=2.319）。

2.3 两组Bsep蛋白表达比较 观察组Bsep蛋白表达阳性率为17.5%，对照组Bsep蛋白表达阳性率为68.2%，两组比较，P＜0.05（χ2=10.19）。

3 讨论

肝癌是消化系统中恶性程度较高的肿瘤之一，目前其病因、发病机制等尚不完全明确，考虑其发病是各种因素综合作用的结果，中间可能涉及一系列受体及介质等的改变。目前普遍认为，乙型、丙型肝炎病毒感染、亚硝胺类物质等与肝癌发病相关，但如何变化并不明确。由于肝癌可能是各种因素叠加而出现的结果，所以治疗棘手。早期肝癌可行根治性手术切除，但如肿瘤发生浸润或远处器官转移，则不能首选手术，而微波治疗、冷冻治疗、化疗、放疗等治疗效果有限，复发率较高。基因治疗是一种尚未广泛用于临床的治疗方案，可能会使更多的肝癌患者获益［2，3］。

Bsep是ATP结合盒超家族蛋白的一员，是一种依赖于ATP的胆盐转运介质，在肝脏中Bsep主要表达于肝毛细胆管膜侧，对胆汁酸的分泌、维持胆汁酸盐浓度的稳定有重要作用［4～6］，在胆汁酸盐的肠肝循环中，肝细胞首先合成胆汁酸，接下来胆汁酸在Bsep作用下主动分泌后转运至肠道，而当胆汁酸进入肠道后，结合胆汁酸在回肠通过一系列介质，包括小肠刷状缘钠盐依赖的胆汁酸转运体，细胞内胆汁酸结合蛋白和基侧膜的终末腔面钠盐依赖的胆汁酸转运体，最终重吸收入门静脉，完成胆汁酸的肠肝循环。而如果Bsep功能紊乱导致胆汁排泄障碍，则可能出现肝内胆汁淤积［7，8］，而由于胆汁淤积，则可能出现胆固醇、胆色素沉积，从而形成结石，而肝内胆管结石的长期存在，反复刺激胆管周围组织产生炎症，进而可能引起肝细胞的恶变。

我们在实验中发现，观察组胆汁中TBA、TC、DBIL水平明显高于对照组，对照组肝脏组织中Bsep基因相对表达量约为观察组的3.87倍，肝脏组织中Bsep蛋白阳性表达率约为观察组的3.89倍，证实肝癌大鼠肝脏肿瘤组织中Bsep基因出现明显变化，说明观察组肝脏肿瘤组织中胆汁酸的分泌及重吸收开始紊乱，随Bsep基因表达的减少，胆汁酸在胆管内大量积聚［9，10］；由此我们初步考虑在正常生理状态时如果胆汁酸增加，则会伴随Bsep基因表达增强，从而加快胆汁酸的排泄，减少胆汁酸的重吸收，降低胆管内胆汁酸的浓度，避免过高浓度胆汁酸对肝细胞的损害；而肝癌时则出现了胆汁酸的代谢障碍，随着Bsep基因表达的减弱，在肝内出现大量胆汁酸淤积，进而导致胆固醇和胆色素的沉积，形成结石，刺激胆管周围组织产生炎症，肝细胞反复出现破坏及增生，进一步可能导致肝脏细胞发生恶变［11，12］。今后我们会在此实验模型建立基础上继续进行Bsep基因增强表达、Bsep基因敲除、多种药物干预等实验，观察肿瘤大小和数量的变化情况。在目前所用治疗肝癌的药物数量及品种稀少，其次普遍存在各种各样的问题，可能无法完全达到治疗目的、服用时间较长、肝肾功能损害大、对胃肠道刺激大，患者可持续接受治疗性差等缺点，上述情况阻碍了其作为临床治疗药物的广泛应用，但目前尚无可直接作用于肝癌相关基因又可产生较好疗效的药物。因此，Bsep基因基因表达变化的发现，可能为基础研究和临床治疗肝癌提供了新方向［13，14］。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.008

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泸州市科学技术局课题（2013-s-48）。

夏先明（E-mail：xxm6206@126.com）

2015-11-15）