NS-398对人结肠癌HCT-8细胞增殖、凋亡的影响及机制

张晓贤，孙剑经，刘华，罗强，张林西（河北北方学院，河北张家口075000；河北北方学院附属第一医院）

NS-398对人结肠癌HCT-8细胞增殖、凋亡的影响及机制

张晓贤1，孙剑经2，刘华1，罗强1，张林西1
（1河北北方学院，河北张家口075000；2河北北方学院附属第一医院）

目的 观察Cox-2选择性抑制剂NS-398对人结肠癌细胞株HCT-8增殖及凋亡的影响，并探讨其机制。方法 取对数生长期的HCT-8细胞，加入终浓度为0、10、20、40、80、160 μmol/L的NS-398进行干预，采用CCK-8法测定NS-398对人结肠癌HCT-8细胞的抑制率；采用流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率，Hoechst 33342染色观察凋亡细胞核形态；0、40、80、160 μmol/L的NS-398作用癌细胞24 h后，免疫细胞化学法检测癌细胞Cox-2、Survivin蛋白表达；ELISA法检测NS-398作用前后培养液中PGE2含量；酶标仪检测Caspase-3/7的活性。结果 NS-398作用后结肠癌HCT-8细胞增殖受到抑制，抑制作用呈时间、浓度依赖性，40、80、160 μmol/L的NS-398作用后细胞生长抑制率比较差异有统计学意义（P均＜0.05）；FCM结果显示，40、80、160 μmol/L的NS-398作用24 h后，细胞凋亡率分别为12%、17%及26%，且呈剂量依赖性；Hoechst 33342染色显示，随着NS-398浓度的增加，核呈致密浓染状，荧光强度增加，细胞凋亡增加。40、80、160 μmol/L的NS-398作用24 h后，癌细胞Cox-2、Survivin蛋白表达较0 μmol/L的NS-398显著减少，细胞培养上清液中PGE2含量较0 μmol/L的NS-398明显下降；同时随NS-398浓度的增加，Caspase-3/7活性上调，呈剂量-效应关系。结论 NS-398可抑制人结肠癌HCT-8细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制Cox-2和Survivin蛋白表达、上调Caspase-3/7活性及抑制PGE2生成有关。

结肠癌；Cox-2选择性抑制剂；细胞凋亡；Survivin蛋白；Caspase-3/7

环氧合酶2（Cox-2）是合成前列腺素的重要限速酶，在结直肠癌中呈高表达［1］。非甾体抗炎药NS-398是Cox-2选择性抑制剂［2］，能较强地抑制Cox-2表达。凋亡抑制因子Survivin通过下调效应分子Caspase-3、Caspase-7的活性阻止癌细胞凋亡［3］。2014年10月～2015年9月，我们观察了Cox-2选择性抑制剂NS-398对人结肠癌细胞株HCT-8的作用，并探讨其可能机制，为结直肠癌的新辅助治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞与试剂：人结肠癌细胞株HCT-8、胰蛋白酶-EDTA消化液及Caspase-3/7活细胞荧光实时法检测试剂盒均购自凯基生物科技发展有限公司；NS-398购自美国Cayman公司；RPMI1640培养基及胎牛血清均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；Hoechst 33342染色液购自北京索莱宝科技有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；二步法免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司；人前列腺素E2（PGE2）酶联免疫分析试剂盒购自美国R&D公司。仪器：BB16HF二氧化碳培养箱购自美国Thermo electron corporation；SW-CJ-1FD超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；TDL-50B低速台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；荧光倒置显微镜购自日本尼康公司；Spectra Max M2e多功能微孔板检测系统购自美国Molecular Devices公司；FACS Aria TMllu流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 细胞生长抑制率测算 采用CCK-8法。将HCT-8细胞培养于含胎牛血清10%，青霉素与链霉素1×105U/L的RPMI1640完全培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期的HCT-8细胞，胰酶消化，调整细胞悬液浓度为1× 105/mL，接种于96孔板，设实验组、对照组和空白组。空白组不进行任何干预，对照组加生理盐水，实验组加药使NS-398终浓度为0、10、20、40、80、160 μmol/L，分别作用24、48 h后，每孔加入CCK-8试剂20 μL，4 h后采用多功能微孔板检测系统于450 nm波长处测OD值。根据OD值计算细胞增殖抑制率（IR），IR=［1-（实验组平均OD值-空白组平均OD值）/（对照组平均OD值-空白组平均OD值）］×100%。

1.3 细胞凋亡检测 采用Annexin V-FITC/PI双染FCM法。取1×105/mL细胞悬液接种于细胞培养瓶。0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，收集细胞，PBS清洗，离心，弃上清，1×Binding Buffer重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC和Propidium I-odide染液，轻轻混匀，室温避光反应15 min，流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.4 细胞凋亡形态观察 采用Hoechst 33342染色法。将1×105/mL细胞悬液接种于6孔板中，每孔3 mL，0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，吸弃培养基，清洗，每孔加入Hoechst 33342染液1 mL，避光孵育25 min，清洗，荧光倒置显微镜下观察。

1.5 Cox-2和Survivin蛋白表达检测 采用免疫细胞化学法。将1×105/mL细胞悬液接种于6孔板中。0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，细胞固定，按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作，显微镜下观察，随机计数高倍视野的细胞。根据结肠癌细胞表达产物染色阳性率分级，大于75%为强阳性（+++），25%～75%为中度阳性（++），低于25%为弱阳性（+），无阳性表达为阴性（-）。

1.6 细胞上清液中PGE2含量测定 采用ELISA法检测。取1×105/mL细胞悬液接种于细胞培养瓶。0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，无菌管收集，2 000 r/min离心20 min后，按PGE2酶联免疫分析试剂盒说明书制作标准曲线及检测PGE2含量。

1.7 Caspase-3及Caspase-7活性测定 将1×105/ mL细胞悬液接种于96孔板，0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，去除药物，洗涤细胞，加入Caspase-3及Caspase-7检测液，37℃，避光孵育30 min，多功能微孔板检测系统在Ex/Em=511/533 nm波长处检测荧光强度。

1.8 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度NS-398干预后HCT-8细胞生长抑制率比较 10、20、40、80、160 μmol/L的NS-398作用HCT-8细胞24 h后，HCT-8细胞的生长抑制率分别为（7.595 ±3.253）%、（9.944±4.543）%、（15.321±2.102）%、（26.232±3.690）%、（43.418±2.185）%，40、80、160 μmol/L的NS-398作用后HCT-8细胞生长抑制率明显高于10、20 μmol/L的NS-398作用后，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。10、20、40、80、160 μmol/L的NS-398作用HCT-8细胞48 h后，HCT-8细胞的生长抑制率分别为（8.726±2.866）%、（11.867±3.453）%、（21.507±2.626）%、（36.856±2.241）%、（52.219± 2.549）%，40、80、160 μmol/L的NS-398作用后HCT-8细胞生长抑制率明显高于10、20 μmol/L的NS-398作用后，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2 不同浓度NS-398干预后HCT-8细胞凋亡率比较 HCT-8细胞凋亡在一定浓度范围内随着NS-398药物浓度的增加而增加，0、40、80、160 μmol/L 的NS-398作用HCT-8细胞24 h后，细胞凋亡率分别为3%、12%、17%及26%，不同浓度间两两比较差异有统计学意义（P均＜0.01），见图1。

图1 不同浓度NS-398作用24 h后HCT-8细胞凋亡率

2.3 细胞凋亡形态变化 0、40、80、160 μmol/L 的NS-398作用24 h后，荧光倒置显微镜下显示一般正常细胞核为均匀的暗蓝色；细胞发生凋亡则核为亮白色，呈碎块状或致密浓染，荧光强度增加。随着NS-398浓度的增加，核呈致密浓染状，荧光强度增加，细胞凋亡增加而导致细胞数量减少，见图2。

图2 荧光倒置显微镜下观察不同药物浓度NS-398作用24 h后的细胞凋亡情况（×200）

2.4 NS-398作用后HCT-8细胞中细胞Cox-2蛋白和Survivin蛋白表达比较 80 μmol/L的NS-398作用结肠癌细胞24 h后，与对照组相比，细胞中Cox-2及Survivin蛋白表达量显著减少。Cox-2蛋白表达于细胞质；Survivin蛋白表达于细胞核/质。Cox-2阳性率由82%下降为24%，由强阳性变为弱阳性，Survivin阳性率由79%下降为21%，同样由强阳性变为弱阳性，差异均有统计学意义（P均＜0.01），见图3。

图3 NS-398作用24 h后Cox-2和Survivin 在HCT-8细胞中的表达（二步法）

2.5 不同浓度NS-398作用后细胞培养上清液中PGE2的含量比较 PGE2含量随NS-398浓度的增加而下降，呈剂量依赖性。0、40、80、160 μmol/L的NS-398作用细胞24 h后，细胞培养上清液中PGE2含量分别为（446.82±12.49）、（384.92±39.28）、（292.11±38.83）、（132.41±46.25）ng/L，各浓度间比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.6 不同浓度NS-398作用后细胞中Caspase-3/7活性比较 随着NS-398浓度的增高，Caspase-3/7活性明显增加，且以高浓度为著，呈剂量依赖性。0、40、80、160 μmol/L的NS-398作用细胞24 h后，Caspase-3/7活性分别为1 260.17±151.13、1 489.99±128.24、1 718.27±159.41、1 967.04± 95.40，各浓度间比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

3 讨论

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其癌谱位置不断攀升［4］。虽然近年有关结直肠癌的研究已取得较大进展，但治疗效果仍不十分满意。本课题从肿瘤的自主增殖和凋亡失调的角度出发，研究Cox-2选择性抑制剂抗肿瘤作用机制。

Survivin作为凋亡抑制蛋白（IAP）家族最强的凋亡抑制因子可抑制细胞凋亡，主要发挥负调控作用［5，6］。Caspase-3和Caspase-7是凋亡促进因子Caspase家族成员，具有诱导凋亡作用［7］。近年多篇文献［8，9］报道了Survivin已广泛表达于胃癌、食管癌、肺癌、宫颈癌等多种人类恶性肿瘤。国内学者对结直肠癌的研究［10］发现，癌组织中的Survivin蛋白表达明显高于正常对照黏膜，且与肿瘤淋巴转移及Duke′s分期密切相关。Survivin对细胞有丝分裂具有调节作用，并抑制细胞发生凋亡，与癌细胞的恶性度有关［11］。因此，如果Cox-2选择性抑制剂能抑制结直肠癌中Survivin表达，促进肿瘤细胞凋亡，则有望为结直肠癌患者的靶向治疗提供理论依据。

Cox是合成前列腺素的重要限速酶。其中Cox-2为诱导型酶，正常情况下一般不表达，癌蛋白、炎症刺激和细胞因子等可刺激Cox-2表达［12］，促进炎症和肿瘤的发生发展。研究［13］显示，Cox-2蛋白在结肠癌的早期阶段如腺瘤中呈高表达状态。Cox-2选择性抑制剂NS-398能较强抑制Cox-2表达。近年研究发现，非甾体类抗炎药具有抗肿瘤作用，主要通过抑制Cox-2表达实现［14］。NS-398是否通过抑制Cox-2表达导致结肠癌HCT-8细胞凋亡及癌细胞中Cox-2与Survivin蛋白表达是否有关需进一步探讨。Cox-2与Survivin在多种肿瘤细胞中共同表达，且二者在刺激细胞增殖和诱导肿瘤新生血管形成、抑制细胞凋亡及促进肿瘤发生转移等方面有类似作用机制。多项研究表明，在胰腺癌［15］、胃癌［16］、宫颈癌［17］、肺癌［18］等多种肿瘤中Cox-2与Survivin表达呈正相关，推测Cox-2可能是通过上调Survivin表达而促进肿瘤发生发展。此外，Cox-2能影响Survivin表达，Cox-2选择性抑制剂能显著降低Survivin在肿瘤细胞中的水平［19，20］。这提示Cox-2选择性抑制剂可能通过抑制Cox-2表达从而影响Survivin水平。

本研究发现，NS-398对结肠癌HCT-8细胞生长有抑制作用，且呈时间和浓度依赖性。FCM结果提示，NS-398在一定浓度范围内呈剂量依赖性增加HCT-8细胞凋亡，这表明NS-398主要通过诱导凋亡作用而抑制结肠癌细胞增殖。Hoechst 33342染色观察凋亡细胞核形态亦证实了这一点。研究［21］表明，Cox-2选择性抑制剂可能通过下调Survivin水平，上调Caspase-3表达，诱导食管癌细胞凋亡。目前关于NS-398对结肠癌的作用是否通过Survivin基因的下调引起细胞凋亡研究报道较少。本研究发现，80 μmol/L的NS-398作用癌细胞24 h后，Cox-2、Survivin表达量较0 μmol/L的NS-398显著减少；同时Caspase-3/7活性明显增加。Cox-2与Survivin表达密切相关，而Survivin与Caspase-3/7表达呈明显负相关。NS-398可能通过抑制Cox-2表达，进而抑制Survivin表达，上调Caspase-3/7的活性，诱导结肠癌细胞发生凋亡。

研究［22］发现，Cox-2选择性抑制剂可使PGE2生成减少，从而逆转肿瘤免疫抑制作用。本研究结果显示，80 μmol/L的NS-398作用HCT-8细胞24 h后，PGE2含量明显低于0 μmol/L的NS-398，而Cox-2蛋白表达与PGE2水平呈正相关。因此可以推测PGE2表达降低可能是Cox-2选择性抑制剂诱导凋亡的又一证据，其具体机制有待进一步探讨。

综上所述，NS-398能显著抑制结肠癌HCT-8生长，主要通过诱导凋亡作用实现。其诱导凋亡作用机制可能是通过抑制Cox-2、Survivin蛋白表达，上调Caspase3/7活性及抑制PGE2含量而实现的。本研究有望为结直肠癌等恶性肿瘤患者的靶向治疗提供理论依据。与此同时，Cox-2选择性抑制剂诱导凋亡的具体机制尚未阐明，有待更进一步探讨。

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Effect and mechanism of NS-398 on proliferation and apoptosis of human colorectal carcinoma HCT-8 cells

ZHANG Xiaoxian1，SUN Jianjing，LIU Hua，LUO Qiang，ZHANG Linxi
（1 Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

Objective To observe the effects of cyclooxygenase-2（Cox-2）selective inhibitor NS-398 on proliferation and apoptosis of colorectal carcinoma HCT-8 cells and to investigate its mechanism.Methods HCT-8 cells in the logarithmic phase were added with 0，10，20，40，80 and 160 μmol/L NS-398 to intervene.The inhibition rate of colorectal carcinoma HCT-8 cells was detected by CCK-8 kit，apoptosis rate was determined by flow cytometry and the cells were stained by Hoechst 33342 and observed under fluorescent inverted microscope further.After HCT-8 cells were treated by 0，40，80 and 160 μmol/L NS-398 for 24 hours，the protein expression of Cox-2 and Survivin were detected by immunocytochemical staining.ELISA analysis were performed to detect PGE2concentration in the culture supernatant of HCT-8，and meanwhile，the activities of Caspase-3/7 were analyzed by automatic fluorescence enzyme-linked immunoassay detector.Results NS-398 inhibited the proliferation of HCT-8 cells in a time-and concentration-dependent manner，and there were significantly differences among the 40，80 and 160 μmol/L NS-398 concentration groups（all P＜0.05）.Flow cytometry revealed，the apoptosis rates were 12%，17%and 26%after treated by 40，80 and 160 μmol/L NS-398 for 24 hours，which was in a dose-dependent manner.Hoechst 33342 staining revealed，the apoptosis increased and cell nucleus showed highdensity fluorescence with the increase of NS-398 concentration.The expression of Cox-2 and Survivin decreased significantly after treated by 40，80 and 160 μmol/L NS-398 for 24 hours，and the level of PGE2 production also significantly decreased as compared with the group of 0 μmol/L NS-398.Meanwhile，the activity of Caspase-3/7 was activated by NS-398 in a dose-dependent manner.Conclusion Cox-2 selective inhibitor NS-398 can inhibit proliferation and induce apoptosisof the colorectal carcinoma HCT-8 cells by down-regulating the expression of Cox-2 and Survivin，PGE2 production and upregulating the activity of Caspase-3/7.

colorectal carcinoma；cyclooxygenase-2 selective inhibitor；apoptosis；Survivin protein；Caspase-3/7

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.003

R979.1；R735.35

A

1002-266X（2016）25-0008-05

河北省高等学校科学技术研究重点项目（ZD20131004）。

张晓贤（1987-），女，硕士，主要研究方向为消化道肿瘤发病机制及临床研究。E-mail：15369318106@163.com

简介：张林西（1968-），男，教授，博士，主要研究方向为消化道肿瘤病理及发病机制。E-mail：zlxwxl@163.com

2016-03-11）