HLA-G1及Th17/Tregs轴相关免疫调节分子在B-ALL中的表达变化及其相关性分析

王欣玉，胡峻岩，2，金真伊，陈少华，杨力建，卢育洪，吴秀丽，李扬秋，（暨南大学医学院血液病研究所，广州5062；2广州医学院第三附属医院；暨南大学第一附属医院）

HLA-G1及Th17/Tregs轴相关免疫调节分子在B-ALL中的表达变化及其相关性分析

王欣玉1，胡峻岩1，2，金真伊1，陈少华1，杨力建1，卢育洪3，吴秀丽1，李扬秋1，3
（1暨南大学医学院血液病研究所，广州510632；2广州医学院第三附属医院；3暨南大学第一附属医院）

目的 观察急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者外周血中人白细胞抗原G1（HLA-G1）及Th17/Tregs轴相关免疫调节分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的基因表达变化，并分析其相关性。方法 收集经MICM分型确诊的29例B-ALL患者外周血样本，初发B-ALL 14例（初发组），复发难治的BALL 8例（复发组），完全缓解的B-ALL 7例（缓解组）；同时收集10例健康志愿者外周血样本作为对照组。采用实时荧光定量PCR法检测各组外周血中膜结合型HLA-G1及Th17/Tregs轴相关免疫调节分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的mRNA相对表达水平。结果 初发组、复发组、缓解组、对照组膜结合型HLA-G1 mRNA相对表达水平分别为0.415%、0.565%、0.108%、0.110%，初发组、复发组与缓解组及对照组比较，P均＜0.05。初发组IL-17A、IL-23、t-bet和CD25基因表达水平显著高于复发组（P均＜0.05）。初发组的FOXP3、IL-17A、IL-23、t-bet、GATA3和CD25基因表达水平亦显著高于缓解组（P均＜0.05）；复发组、初发组、缓解组ROR-γ mRNA相对表达水平分别为2.777%、1.425%、0.089%，复发组与初发组、缓解组比较，P均＜0.05。初发组HLAG1 mRNA表达水平与IL-17A和FOXP3相对表达水平呈正相关（r分别为0.635、0.647；P均＜0.05），且HLA-G1 mRNA表达水平与IL-17A呈正相关（r=0.573，P＜0.05）。初发组HLA-G1 mRNA表达水平与IL-23、ROR-γ、RORα、t-bet、GATA-3、CD25表达水平无明显相关关系（P均＞0.05）。复发组HLA-G1表达水平与各免疫相关调节分子均未发现明显相关性（P均＞0.05）。缓解组HLA-G1表达水平与IL-17A和FOXP3表达水平呈负相关（r分别为-0.857、-0.785，P均＜0.05），而与其他免疫相关调节分子表达水平无显著相关关系（P均＞0.05）。对照组HLA-G1表达水平与t-bet表达水平呈负相关（r=-0.665；P＜0.05），与其他免疫相关调节分子均未见显著相关关系（P均＞0.05）。结论 初发及复发B-ALL患者外周血中膜结合型HLA-G1基因表达水平显著升高，缓解后HLA-G1基因水平下降；且初发患者HLA-G1表达水平与IL-17A和FOXP3存在正相关关系，ROR-γ基因与复发BALL关系密切。HLA-G1和ROR-γ可能参与调节Th17/Tregs轴的平衡，影响B-ALL预后。

急性B淋巴细胞白血病；人白细胞抗原G1；调节性T细胞

急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）是一种具有异质性的疾病，以原始、幼稚B淋巴细胞恶性克隆增殖为主要特征，患者的疗效和预后存在明显个体差异。探寻新的与B-ALL预后相关的靶基因对于探讨白血病靶向治疗新策略和指导临床分层治疗有重要意义。人白细胞抗原G（HLA-G）属于HLA-Ⅰb类分子，具有一定免疫调节作用［1］，其表达水平可能与慢性B淋巴细胞白血病预后相关，且其临床敏感度较慢性B淋巴细胞白血病的独立预后指标CD38、ZETA相关蛋白ZAP-70更高［2］。本课题组前期研究发现，在B-ALL患者中，高表达膜结合型HLA-G1基因组的B-ALL复发率高于低表达HLAG1基因组［3］。HLA-G影响白血病的预后可能与其能诱导生成新型的调节性T细胞（Tregs）［4］，从而影响TH17/Tregs轴平衡有关［1］，然而其具体免疫调节相关机制暂且不明确。2014年4月～2015年3月，我们定量分析了不同临床状态B-ALL患者外周血中HLA-G1及Th17/Tregs轴相关免疫调节分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的基因表达水平及其相关性，初步探究B-ALL相关免疫调节分子机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集经MICM分型（细胞形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学分型）确诊的29 例B-ALL患者外周血样本，其中男13例、女16例，年龄3～70岁，中位年龄27岁。初发B-ALL 14例（初发组），复发难治的B-ALL 8例（复发组），完全缓解的B-ALL 7例（缓解组）。同时收集10例健康志愿者外周血样本作为对照组，男5例、女5例，年龄19～35岁，中位年龄27岁。研究样本征得健康志愿者及患者的同意并签署知情同意书，且本研究采样通过医院伦理委员会批准。

1.2 外周血单个核细胞（PBMNCs）分离、RNA提取和cDNA合成［5，6］采集B-ALL患者和健康志愿者外周静脉血，采用Ficoll密度梯度离心法常规分离PBMNCs，以1×PBS重悬细胞并计数；应用TRIzol试剂盒（Invitrogen，USA）提取mRNA，并应用反转录酶试剂盒（PowerScriptTM Reverse，BD，USA）合成cDNA。合成的cDNA经RT-PCR检测β2微球蛋白（β2M）管家基因的表达情况并确定其质量。根据HLA-G1、FOXP3、IL-17A、IL-23、ROR-γ、RORα、tbet、GATA-3、CD25及β2M基因分别设计上下游引物。

1.3 HLA-G1基因和Th17/Tregs轴相关免疫调节分子在B-ALL患者外周血中的表达检测 采用实时荧光定量PCR法。以β2M基因作为内参基因，采用RealMaster Mix试剂盒（Tiangen，北京），通过SYBR Green I染料法检测PBMNCs中HLA-G1基因及Th17/Tregs轴相关免疫调节分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的表达水平。反应体系包括2.5×RealMaster Mix 10 μL、0.6 mmol/L上、下游引物及1 μL cDNA，总反应体系为20 μL；每一标本设2个复孔。反应在CFX96荧光定量PCR仪（Bio-Rad，USA）中进行，反应条件：95℃15 min，95℃30 s，60℃1 min，80℃读板，共45个循环，随后，以0.5℃/s变化速度从95℃到55℃每隔5 s记录荧光值，最后获得熔解曲线。样本均重复检测2次。采用相对定量法分析B-ALL患者和健康志愿者HLA-G1基因及免疫调节相关分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的mRNA相对表达水平，目的基因mRNA相对表达量= 2-Δ（Ct目的基因-Ct内参基因）×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。两样本比较采用Mann-Whitney非参数检验，采用Pearson和Spearman相关分析法分析HLA-G基因与免疫调节相关分子的相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血中HLA-G1基因和Th17/Tregs轴相关免疫调节分子的表达水平比较 初发组、复发组、缓解组、对照组膜结合型HLA-G1 mRNA相对表达水平（M）分别为0.415%、0.565%、0.108%、0.110%，初发组、复发组与缓解组及对照组比较，P均＜0.05；缓解组与对照组比较无统计学差异（P= 0.96）。初发组IL-17A、IL-23、t-bet和CD25基因表达水平显著高于复发组（P均＜0.05）。初发组的FOXP3、IL-17A、IL-23、t-bet、GATA3和CD25基因表达水平亦显著高于缓解组（P均＜0.05）；复发组、初发组、缓解组ROR-γ mRNA相对表达水平（M）分别为2.777%、1.425%、0.089%，复发组与初发组、缓解组比较，P均＜0.05。复发组IL-17A、IL-23、GATA3和FOXP3 mRNA相对表达水平显著高于缓解组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25 mRNA相对表达水平比较（M%）

2.2 HLA-G基因与免疫调节相关分子的相关性分析 初发组HLA-G1 mRNA表达水平与IL-17A和FOXP3相对表达水平呈正相关（r分别为0.635、0.647，P均＜0.05），且HLA-G1 mRNA表达水平与IL-17A呈正相关（r=0.573，P＜0.05）。初发组HLA-G1 mRNA表达水平与IL-23、ROR-γ、RORα、tbet、GATA-3、CD25表达水平无明显相关关系（P均＞0.05）。复发组HLA-G1表达水平与各免疫相关调节分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）均未发现明显相关性（P均＞0.05）。缓解组HLA-G1表达水平与IL-17A和FOXP3表达水平呈负相关（r分别为-0.857、-0.785，P均＜0.05），而与其他免疫相关调节分子表达水平无显著相关关系（P均＞0.05）。对照组HLA-G1表达水平与t-bet表达水平呈负相关（r=-0.665，P=0.035），与其他免疫相关调节分子FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23 和CD25均未见显著相关关系（P均＞0.05）。

3 讨论

HLA-G的初始转录物经过差异剪接，产生7种mRNA异构体，分别编码4种膜结合性抗原（HLAG1～G4）和3种三种可溶性抗原［4］。正常生理状态下，HLA-G抗原主要限制表达于成人胸腺上皮、绒毛外滋养层细胞、胰岛和胎盘等组织［1］，与机体免疫耐受有关。在病理状态下，HLA-G抗原亦能表达于病毒感染［7］、炎症反应、器官移植术后等病理组织，并且可能在巨细胞病毒等病毒感染逃避机体免疫监控中发挥重要作用。HLA-G与肿瘤免疫亦有密切相关性，在肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、乳腺癌及淋巴瘤等肿瘤组织中可见HLA-G抗原表达［8］。HLA-G可通过与表达在T细胞上的受体联合而转导负调控信号，帮助肿瘤细胞逃避机体CD8+T细胞和NK细胞的杀伤［9］，并有效地抑制CD4+T细胞的增殖。HLA-G还能抑制树突状细胞（DC）等抗原提呈细胞的成熟和活化，影响抗原提呈，阻碍未致敏T细胞的分化。此外，HLA-G能诱导T细胞分化成有免疫抑制功能的新型CD3+CD8low或CD3+CD4low调节性T细胞［1，4］，可能影响TH17/Tregs的平衡。

HLA-G能影响白血病的预后［2，3］，可能是通过诱导生成新型调节性T细胞［4］，从而影响TH17/ Tregs平衡［1］，参与疾病的发生发展。然而其免疫调节相关机制尚不明确。本研究发现B-ALL外周血中HLA-G表达水平发生显著变化，初发及复发BALL患者外周血中膜结合型HLA-G1基因表达水平显著增高，缓解后HLA-G1基因水平下降；提示HLA-G1的异常高表达可能与B-ALL的发生发展密切相关，B-ALL肿瘤细胞可能通过分泌HLA-G1分子，降低机体的免疫监视功能，帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸。

Th17细胞是由初始CD4+T细胞分化而来，在自身免疫性疾病、炎症反应性疾病、肿瘤及移植物抗宿主等疾病的发生发展过程中发挥重要作用［10］。Treg细胞则是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，具有低反应性和免疫抑制性，与肿瘤细胞免疫逃逸相关。Th17/Treg细胞间的平衡与疾病的转归密切相关［11］。因此，本研究中检测了B-ALL中Th17/ Tregs轴相关免疫调节分子（FOXP3、RORα、t-bet、ROR-γ、GATA-3、IL-17A、IL-23和CD25）的表达水平，结果发现初发组IL-17A、IL-23、t-bet和CD25基因表达水平显著高于复发组，初发组FOXP3、IL-17A、IL-23、t-bet、GATA3和CD25基因表达水平亦显著高于缓解组，提示在初发B-ALL中，外周血T细胞激活增强，免疫调节分子的表达水平发生改变，可能引起相关的T细胞亚群如Th1、Th2、Th17和调节性T细胞的表达分布变化，并可能参与B-ALL的整个发病过程。在初发B-ALL中，HLA-G1表达水平与IL-17A和FOXP3表达水平呈正相关，且HLAG1与IL-17A呈正相关；而在缓解B-ALL中，HLAG1表达水平与IL-17A和FOXP3表达水平呈负相关。提示在B-ALL疾病发展过程中，HLA-G1可能通过影响Th17细胞和Treg细胞相关免疫调节分子的表达，从而调控Th17/Treg轴的谱系平衡，参与BALL的发生发展。本研究还发现在复发B-ALL中ROR-γ基因的表达量显著高于初发组和缓解组。由于ROR-γ是Th17细胞的特异性转录因子，在Th17细胞分化发育中起重要作用，复发B-ALL患者中ROR-γ基因表达量的增高，可能与Th17/Treg细胞比例失衡有关。监测B-ALL患者的ROR-γ基因表达水平对于评价B-ALL的预后可能有潜在参考价值。

总之，本研究首先提供了初发、复发难治及完全缓解状态的B-ALL外周血中HLA-G1及Th17/Tregs轴相关免疫调节分子的基因表达情况，为深入研究B-ALL中的免疫调控机制提供了基础资料。

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Expression and correlation of HLA-G1 and Th17/Tregs axis associated regulatory factors in B-ALL

WANG Xinyu1，HU Junyan，JIN Zhenyi，CHEN Shaohua，YANG Lijian，LU Yuhong，WU Xiuli，LI Yangqiu
（1 Institute of Hematology，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Objective To investigate the expression changes of human leukocyte antigen-G1（HLA-G1）and Th17/ Tregs axis associated regulatory factors（FOXP3，IL-17A，IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25）in peripheral blood from adult patients with B-cell acute lymphocytic leukemia（B-ALL）and its correlation.Methods The mRNA expression levels of HLA-G and Th17/Tregs axis associated regulatory factors（FOXP3，IL-17A，IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25）were detected in peripheral blood from 29 cases of MICM type-confirmed patients with B-ALL，including 14 cases of primary patients（primary group），8 cases of patients with refractory relapse B-ALL（recurrence group）and 7 cases of patients with complete remission（CR）（remission group）by real-time quantification RT-PCR. Meanwhile，10 healthy individuals（HI）were selected as the control group.Results The expression levels of HLA-G1gene in the primary group，recurrence group，remission group and control group were 0.415%，0.565%，0.108%and 0.110%，respectively.Significant differences were found among the primary group，recurrence group，remission group and control group（all P＜0.05）.The expression levels of IL-17A，IL-23，t-bet and CD25 genes in the primary group were significantly higher than those of the recurrence group（all P＜0.05）.The expression levels of FOXP3，IL-17A，IL-23，tbet，GATA-3 and CD25 genes in the primary group were also significantly higher than those of the remission group（all P＜0.05）.The expression levels of ROR-γ mRNA in the recurrence group，primary group and remission group were 2.777%，1.425%and 0.089%，respectively（all P＜0.05）.The mRNA expression of HLA-G1 was positively correlated with IL-17A and FOXP3 in the primary group（r=0.635，0.647，respectively；all P＜0.05），and meanwhile，the mRNA expression of HLA-G1 was positively correlated with IL-17A（rs=0.573，P＜0.05）.No statistically significant correlation was found between the expression levels of HLA-G1 and IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25 in the primary group（all P＞0.05）.In the recurrence group，no statistically significant correlation was found between the HLA-G1 expression and Th17/Tregs axis associated regulatory factors（FOXP3，IL-17A，IL-23，ROR-γ，RORα，t-bet，GATA-3 and CD25）（all P＞0.05）.In the remission group，a negative correlation was found between the HLA-G1 expression and IL-17A（r=-0.857，P＜0.05）or HLA-G1 and FOXP3（r=-0.785，P＜0.05）.In the control group，the HLA-G1 expression was negatively correlated with t-bet（r=-0.665，P=0.035），but was not related with the other regulatory molecules（all P＞0.05）.Conclusions HLA-G expression increases in untreated and refractory relapse B-ALL patients and decreases after CR.A positive correlation is found between the HLA-G1 expression and IL-17A，HLA-G1 and FOXP3 in the primary B-ALL patients.In the Th17/Tregs axis associated regulatory factors，ROR-γ gene is closely related with the recurrence of B-ALL.HLA-G1 and ROR-γ gene may influence the balance of Th17/Tregs and further affect the prognosis of B-ALL.

B-cell acute lymphocytic leukemia；human leukocyte antigen-G1；regulatory T cells

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.007

R733.7

A

1002-266X（2016）25-0024-04

国家自然科学基金资助项目（81570143）；广东省医学科研基金资助项目（B2013183）。

王欣玉（1990-），女，医师，硕士研究生，主要研究方向为血液肿瘤免疫。E-mail：xiaote007@qq.com

简介：吴秀丽（1978-），女，副研究员，博士，主要研究方向为血液肿瘤免疫。E-mail：siulier@163.com

2016-03-02）