应用固定化醋酸菌生产番木瓜果醋的研究

兰维杰,陈琴媛,刘继,叶昕轶,何靖柳,郭元照,秦文,*

(1.四川农业大学食品学院,四川雅安 625014;2.成都市农林科学院,四川成都 610000)



应用固定化醋酸菌生产番木瓜果醋的研究

兰维杰1,陈琴媛1,刘继2,叶昕轶1,何靖柳1,郭元照1,秦文1,*

(1.四川农业大学食品学院,四川雅安 625014;2.成都市农林科学院,四川成都 610000)

以番木瓜为原料,用3%海藻酸钠与0.05 mol/L氯化钙对醋酸菌进行固定,并以正交实验方法对固定化醋酸菌酿造木瓜果醋的醋酸发酵工艺进行了研究。结果表明,固定化醋酸菌酿造木瓜果醋的较适工艺参数为初始pH5.0、温度32.5 ℃、接种量13%、初始酒度8%,最终酸度达到4.78 g/100 mL;与游离醋酸菌发酵木瓜果醋对比,固定化方法发酵具有较高的产酸速率;在批次发酵木瓜醋的实验中,最短只需要24 h,木瓜果醋酸度即达到4.40 g/100 mL,连续发酵10个批次,产酸率基本保持在0.40 g/L·h左右。

木瓜,果醋,固定化醋酸菌,醋酸发酵

番木瓜(Carica papaya L.)是一种热带常绿果树,为番木瓜科番木瓜属多年生肉质草本植物[1],又名乳瓜、石瓜、万寿果、番瓜、木冬瓜、木瓜、莲生果[2]。现代医学证明:番木瓜果实含木瓜碱、木瓜蛋白、凝乳、胡萝卜素等。其中所含的齐墩果酸是一种具有护肝降压、抗炎抑菌、降低血脂等功效的化合物[3]。熟番木瓜果肉呈黄色或红色,黄色果肉主要含胡萝卜素,红色果肉主要含番茄红素,均具有卓越的保健功效和重要的食用价值与工业价值[4]。早在2000年,夏杏洲等[5]人就用成熟番木瓜为主要原料,经酒精发酵、醋酸发酵生产果醋;2013年,王宇鸿等[6]人以番木瓜、芒果为原料,酿制出番木瓜芒果复合果醋。本实验采用的实验材料是番木瓜新品种——穗中红[7]。

固定化细胞发酵法易于实现生产的连续化和提高产品质量的稳定性,已被广泛应用于工业及药物等领域[8]。但目前国内尚未见到此法生产木瓜果醋的研究报道。海藻酸盐是一种广泛应用的固定化介质,具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点[9]。本研究以番木瓜为原料,选用优良的醋酸菌,采用海藻酸钠包埋法按液态法酿造工艺进行固定化醋酸菌发酵,以期为木瓜果醋的生产提供可靠的技术依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

番木瓜(Carica Papaya L.)穗中红,原产广东省,收购于攀枝花;巴氏醋酸杆菌巴氏亚种(Acetobacter pasteurianus subsp. Pasteurianus)中国工业微生物菌种保藏管理中心提供,CICC编号:7005;海藻酸钠、氯化钙、氢氧化钠、酵母膏均为分析纯;醋酸菌液体培养基葡萄糖100.0 g,酵母提取物10.0 g,碳酸钙20.0 g,蒸馏水1000 mL,pH=6.8;固定化醋酸菌发酵培养基自行酿制木瓜果酒。

LDZX-40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海三申医疗核子仪器厂;SW-CJ-1F洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司;OLYMPUS显微镜OLYMPUS;PB-2B pH计SARTORIUS;DHG-9162电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司;B4i-BR4i冷冻离心机BR4i multifunction,Thermo;酒精计。

1.2实验方法

1.2.1番木瓜果醋的酿制技术路线如图1所示。

图1　技术路线Fig.1　The technical route

1.2.2番木瓜果酒的制备取原料木瓜,除残果去核,榨汁,接种0.6%酿酒酵母,用蔗糖调整可溶性固形物为16°Brix,用柠檬酸钠调节pH=3,28 ℃静置发酵,测定木瓜果酒的酸度0.204 g/100 mL,可溶性固形物5.1°Brix,pH3.6,酒精度10%(v/v)。

1.2.3固定化醋酸菌的制备取等量的菌悬液和3%海藻酸钠溶液混合均匀后,用一次性注射器将混合液滴入0.05 mol/L氯化钙溶液中造粒,于4 ℃条件下在氯化钙溶液中保存过夜备用[10]。固定化颗粒性质见表1。

表1　固定化颗粒的性质

1.2.4醋酸发酵的单因素实验每个实验号取100 mL木瓜果酒放入300 mL锥形瓶中进行振荡发酵,每天取样测定发酵液的总酸,至酸度不变,以发酵结束时的酸度为指标确定单因素的最佳水平。每组三个重复。

1.2.4.1初始酒精度对固定化醋酸菌发酵的影响加水稀释分别调整初始酒精度(v/v)为5%、6%、7%、8%、9%,调初始pH为4.5,再分别接入15%固定化醋酸菌粒子,31 ℃摇床发酵。

1.2.4.2接种量对固定化醋酸菌发酵的影响将木瓜酒液的酒精度调整为7%,调初始pH为4.5,分别接种固定化醋酸菌(w/v)5%、10%、15%、20%、25%,31 ℃摇床发酵。

1.2.4.3初始pH对固定化醋酸菌发酵的影响将木瓜酒液的酒精度调整为7%,接种量为15%,用氢氧化钠分别调整pH为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5,31 ℃摇床发酵。

1.2.3.4温度对固定化醋酸菌发酵的影响调整木瓜果酒初始酒精度为7%,接种量为15%,调初始pH为4.5,分别在25、28、31、34、37 ℃下摇床发酵。

1.2.3.5醋酸发酵正交实验在单因素实验的基础上,进行正交实验L9(34),研究酒精度、接种量、初始pH、温度对木瓜果醋发酵的影响,正交实验因素水平见表2。以第3 d的最终酸度(g/100 mL)为测定指标来确定醋酸发酵的最佳工艺条件。每个实验号取木瓜果酒100 mL。

表2　正交实验因素水平表

1.2.4澄清处理以6 g/L壳聚糖为澄清剂,摇匀,于25 ℃的条件下静置24 h后,取上清液测定透光率[11-12]。

1.2.5游离与固定化醋酸菌酿造木瓜果醋的比较按13%(w/v)的接种量取两份菌悬液,一份进行固定化,用于固定化发酵,另一份用于游离醋酸菌发酵。无菌操作下将两份醋酸菌分别移入100 mL初始酒度为7.5%、pH4.5的木瓜果酒中,置于32.5 ℃恒温培养箱中摇床培养(220 r/min),发酵7 d,每天测定酸度。以最终酸度及产酸率比较固定化醋酸菌与游离醋酸菌的发酵性能。

1.2.6固定化醋酸菌连续发酵实验取13%(w/v)固定化醋酸菌放入500 mL三角瓶中,加120 mL木瓜果酒(8% vol),32.5 ℃摇床发酵(220 r/min)。每天测定酸度,当酸度达到4.5 g/100 mL左右时,取出60 mL的醋酸发酵液,然后再流加60 mL的酒液(8%vol),连续10个批次。

1.3测定方法

1.3.1固定化颗粒包埋量的测定取固定化颗粒10颗,用pH5.0的柠檬酸缓冲液溶解后再用平板计数,最后折算为每个粒子的包埋量[13]。

1.3.2固定化颗粒渗漏量的测定将固定化颗粒培养24 h,用平板计数法计数发酵液中的细胞数,用发酵液中的细胞浓度表示固定化细胞的渗漏量[14]。

1.3.3固定化颗粒机械强度的测定挑选3个大小均匀的固定化颗粒,放在水平玻片上,用50 g砝码加压60 s,用游标卡尺分别测定颗粒加压前后的直径,结果取平均值。以颗粒加压后与加压前直径比来表示机械强度[15]。

1.3.4产酸速率的测定根据发酵前和发酵后的总酸,计算产酸速率[16]

式中:X为产酸率,g/L·h;X1为发酵后总酸含量(以醋酸计),g/100 mL;X2为发酵前总酸含量(以醋酸计),g/100 mL;h为发酵时间,h。

1.3.5理化指标的测定pH用pH计进行测定,可溶性固形物测定采用手持折光仪(°Brix)进行测定[12],根据GB/T 12456-2008酸碱中和法测定总酸、GB/T 11856-2008蒸馏法测定酒精度和考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质。

1.4数据分析方法

利用Origin、SPSS(数据统计软件)和Excel对实验数据进行处理和统计分析。

2　结果与分析

2.1单因素结果与分析

2.1.1初始酒精度对固定化醋酸菌发酵的影响由图2可知,酒精度为7%的处理组酸度显著高于5%和6%,这主要是由于酒精是醋酸发酵的底物,在一定底物浓度范围内,发酵酸度随底物浓度的增高而增大。5%、6%、7%、8%、9%酒精度的各处理达到最大酸度值的时间分别为3、3、3、6、6 d,这主要是由于过高的酒精度对醋酸菌的生长繁殖有抑制作用,导致产酸速率较低。酒精度为7%的处理组能够在较短时间内达到较高的酸度,因此,该酒精度较适合于固定化醋酸菌醋酸发酵。

图2　初始酒精度对固定化醋酸菌发酵的影响Fig.2　Effect of initial alcohol degree on acetic acid fermentation

2.1.2接种量对固定化醋酸菌发酵的影响由图3可知,接种量为15%的处理组酸度显著大于其他处理组,接种量25%的处理组酸度显著小于其他处理组,这可能是由于接种量过少时初期菌体量不够,产酸能力较弱;接种量过大,菌体生长繁殖消耗了过多底物,导致产酸速率和最终酸度较低。其中5%、10%、15%、20%、25%接种量的各处理达到最大酸度值的时间分别为5、5、3、5、3 d。因此接种量为15%的处理组能够在较短时间内达到较高的酸度,该接种量较适合于固定化醋酸菌醋酸发酵。

图3　接种量对固定化醋酸菌发酵的影响Fig.3　Effect of inoculums amount on acetic acid fermentation

2.1.3初始pH对固定化醋酸菌发酵的影响由图3可知,初始pH为4.5的处理组酸度显著高于其他实验组,其中pH为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5的各处理组达到最大酸度的时间分别6、5、3、5、5 d。因此pH为4.5的处理组能够在较短时间内达到较高的酸度,该pH较适合于固定化醋酸菌醋酸发酵。

图4　初始pH对固定化醋酸菌发酵的影响Fig.4　Effect of inoculums pH on acetic acid fermentation

2.1.4温度对固定化醋酸菌发酵的影响由图4可知,温度为31 ℃和34 ℃的处理组酸度显著高于其他处理组,温度为37 ℃的处理组酸度显著低于其他处理组。其中25、28、31、34、37 ℃温度的各处理达到最大酸度的时间分别为5、5、3、3、5 d。因此温度为31 ℃和34 ℃的处理组能够在较短时间内达到较高的酸度,故初步确定醋酸菌发酵适宜温度范围为31～34 ℃。

图5　温度对固定化醋酸菌发酵的影响Fig.5　Effect of temperature on acetic acid fermentation

2.2正交实验结果

由表3的实验结果,结合方差分析表4可知:从比较实验中A、B、C、D极差R的大小,可以看出三因素的主次关系是D(初始酒精度)>C(接种量)>A(pH)>B(温度)。显著性检验表明初始酒度(D)、接种量(C)和初始pH(A)对醋酸发酵的影响表现为极显著,温度(B)对醋酸发酵的影响表现为不显著。

2.3木瓜果酒固定化发酵最佳工艺的验证实验

从在正交表的9组实验中,A1B2C1D3并未包括在内,因此需要做进一步实验。将理论所得的最佳组合A1B2C1D3与正交表中的最佳工艺组合A3B2C1D3进行比较,结果见表5。

表5　验证实验结果

表6　120 mL连续发酵实验结果

注:表中同一列数据后标有相同字母表示在进行Duncan’s检验时在0.05水平无显著差异。

由表5可知木瓜果酒固定化发酵正交表中的最佳工艺组合(A3B2C1D3)最终酸度为4.78 g/100 mL,理论得到的最佳工艺组合(A1B2C1D3)最终酸度为4.76 g/100 mL,由此可确定木瓜果酒固定化发酵最佳工艺条件是A3B2C1D3,即初始pH5.0、温度32.5 ℃、接种量13%、初始酒度8%。

2.4固定化醋酸菌细胞与游离细胞发酵比较结果

由图6可知,固定化醋酸菌前期产酸是直线上升的,到第3 d左右达到高峰,酸度为4.688%。在同样条件下,木瓜果酒接种游离醋酸菌,前期产酸较慢,经过24 h左右的培养,产酸加快,到第4 d左右达到高峰,最终酸度与固定化醋酸菌产生的醋酸度相近。

图6　固定化醋酸菌细胞与游离细胞发酵比较Fig.6　Comparison of acetic fermentationbetween immobilized and planktonic acetic acid bacteria

2.5固定化醋酸菌连续发酵实验

由表6可知,连续流加10个批次,酸度都保持在4.10 g/100 mL以上,产酸率在0.37 g/L·h以上,前3批产酸率较低,第4批有所上升,第5批达最高0.77 g/L·h,第6批又开始下降,到第8批之后保持在0.40 g/L·h左右。

以上结果表明:菌株前期需活化、增殖,所以第一批发酵时间较长,为96 h;随着菌数稳定后,发酵时间逐渐缩短,第5批次产酸率最高,只需24 h酸度即达到4.40 g/100 mL,第8批之后菌株开始退化,产酸率又有所下降,发酵时间最终稳定为48 h。

3　讨论

采用固定化发酵工艺比游离细胞发酵工艺周期短,产酸率比游离醋酸菌高,这可能是因为固定化发酵系统中的反馈抑制效应要比游离发酵系统中小,在发酵前期尤为明显,使得固定化发酵系统内细胞浓度明显高于游离发酵系统,从而加快了产酸速率。该结果与李西腾等[18]人利用固定化细胞技术发酵草莓醋的结果一致。其次,固定化醋酸菌发酵较游离细胞发酵易于实现连续化,且不同批次间产品质量更稳定。

木瓜果醋发酵之后,发酵液中菌数上升,这是由于在发酵过程中,由于醋酸菌细胞的不断生长会造成固定化醋酸菌的机械强度不断下降,从而发生细胞泄漏,最终导致固定化醋酸菌的发酵性能有所下降,因此,我们在使用过程中,要解决好固定化醋酸菌容易破裂的问题。

4　结论

固定化醋酸菌酿造木瓜果醋的较适工艺参数为初始pH5.0、温度32.5 ℃、接种量13%、初始酒度8%,最终酸度达到4.78 g/100 mL。

在相同的发酵条件下,固定化醋酸菌发酵速度较游离醋酸菌快,发酵周期较游离醋酸菌短。

固定化技术连续发酵木瓜果醋10批次研究结果表明,最短只需24 h,木瓜果醋酸度即达4.40 g/100 mL,连续发酵10个批次的产酸率基本保持为0.40 g/L·h左右。

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Study on fermentation of papaya vinegar with immobilized acetobacter aceti

LAN Wei-jie,CHEN Qin-yuan,LI Ji,YE Xin-yi,HE Jin-liu,GUO Yuan-zhao,QIN Wen*

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Science,Chengdu 610000,China)

Using Papaya as raw material,3% sodium alginate was used to immobilize acetic acid bacteria in the 0.05 mol/L calcium chloride,the production of Papaya vinegar by the fermentation of immobilized acetic acid bacteria was studied.Results showed that optimum parameters were as follows 8% alcohol degree,13% inoculums amount,pH5.0,32.5 ℃,the total acid content was 4.78 g/100 mL;The yield of acid produced by immobilized acetic acid bacteria was higher compared to that of planktonic acetic acid bacteria;It was found that the highest acidity could reach 4.40 g/100 mL after 24 h and the rate of acid production was around 0.40 g/L·h in 10 batches of continuous fermentation.

Carica Papaya L.;vinegar;immobilized acetic acid bacteria;acetic acid fermentation

2015-02-12

兰维杰(1992-),男,硕士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:lwj18728158690@163.com。

秦文(1967-),女,博士,四川农业大学教授,研究方向:果蔬加工及贮藏,E-mail:qinwen1967@yahoo.com.cn。

TS

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000