引入疏水性氨基酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响

2016-09-12李同彪周晨妍朱新术王丹丹

食品工业科技 2016年1期

关键词：新乡聚糖热稳定性

李同彪,周晨妍,*,朱新术,王丹丹,2

(1.新乡医学院生命科学技术学院,河南新乡 453003;2.新乡医学院三全学院,河南新乡 453003)

引入疏水性氨基酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响

李同彪1,周晨妍1,*,朱新术1,王丹丹1,2

(1.新乡医学院生命科学技术学院,河南新乡 453003;2.新乡医学院三全学院,河南新乡 453003)

木聚糖酶,热稳定性,α-螺旋,疏水性,定点突变

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一种可以内切β-1,4糖苷键的糖苷类水解酶[1]。基于木聚糖酶与底物作用方式、初级结构以及疏水性的不同,木聚糖酶主要分为GH11和F10家族[2]。相比F10家族,GH11家族的木聚糖酶具有底物特异性,可以催化含有D-木糖的底物[3],GH11家族木聚糖酶的三维结构呈右手半握状,主要由一个α-螺旋和两个β-折叠片层组成,结构简单[4]。木聚糖酶在饲料加工、烘烤、造纸、制药、酿造以及生物燃料等多个领域具有很大的应用潜力[5]。目前,大多数木聚糖酶属于中温木聚糖酶,阻碍了工业应用的进程。在工业应用中,耐热木聚糖酶可以提高生产效率、降低能源消耗以及污染率[6]。因此,提高木聚糖酶热稳性已成为研究者广泛关注的焦点问题。目前,通过生物信息学分析比对木聚糖酶晶体结构发现,提高氢键和离子键数目[7]、N端的延伸、分子内部引入二硫键[8]、增强分子内部以及α-螺旋处的疏水作用[9]等可以提高木聚糖酶的热稳定性。这些发现为木聚糖酶热稳定性的研究提供了理论依据。

目前,对于增强分子结构内部疏水作用以提高GH11家族木聚糖酶热稳定性的研究相对较少,但已取得了显著的成果。如Taeho Kim等[10]利用网络分析来源于Bacilluscirculans木聚糖酶分子内的疏水作用,通过定点突变(W58F、G64A、K95L、H156V、M158L和V168I)整合k-clique更高的疏水作用集群,稳定木聚糖酶的局部结构以提高木聚糖酶的热稳定性,并发现该酶的半衰期提高了78倍,解链温度提高了8.8 ℃。由此可见,良好的疏水性氨基酸集群构象对木聚糖酶的热稳定性也起着至关重要的作用。

本实验室前期已从黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中分离出木聚糖酶基因xynZF-2,并实现在大肠杆菌BL21中异源表达的基础上[11],本文利用生物信息学及分子生物学技术等手段,从分析酶的构效关系为切入点,引入疏水性氨基酸,增强疏水作用,以期提高木聚糖酶XynZF-2的热稳定性,为该酶后续研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

表达质粒pET-28a、EscherichiacoliJM109、BL21(DE3)均购自Novagen公司,重组质粒pET-28a-xynZF-2由本实验室构建保存;DNA质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自Sangon公司;限制性内切酶、DL1000 DNA Marker、TA克隆载体pMDTM18-T、IPTG、X-gal及T4DNA Ligase购自TaKaRa公司;其他试剂主要来源于是进口或国产分析纯。蛋白分子量标准购自碧云天生物技术有限公司。

梯度PCR扩增仪C1000 Bio-Rad Laboratory;稳压稳流电泳仪(DYY-2)北京市六一仪器厂;DC-0506低温恒温槽上海比朗仪器有限公司;HZQ-F160A恒温振荡器上海一恒科学仪器有限公司;高速冷冻离心机(Neofuge 23R)上海力申科学有限公司。

1.2活性中心预测及同源序列建模

木聚糖酶XynZF-2催化活性中心预测在http://prosite.expasy.org网站上完成[12]。在http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index网站上完成对XynZF-2、XynED以及XynMA的同源序列比对及建模。

1.3定点突变

依据引物设计原则,设计突变位点上下游引物(见表1)。采用重叠延伸PCR法[13]以及两步PCR法[14]进行目的基因定点突变。以重组质粒pET-28a-xynZF-2为模板,分别扩增突变基因xynED(含有E103D、E194D突变位点)以及xynMA(含有V125A、K178M以及G180A突变位点)。TA克隆,构建重组载体pMDTM18-T-xynED以及pMDTM18-T-xynMA,转化大肠杆菌JM109,经蓝白斑筛选,送金唯智公司测序。

表1　突变引物名称及序列

注:阴影碱基表示限制性内切酶位点,下划线碱基为突变位点。

1.4重组木聚糖酶基因表达载体的构建

转化菌株经测序正确后,提取重组质粒pMDTM18-T-xynED及pMDTM18-T-xynMA,以此为模板,PCR扩增突变基因xynED和xynMA。限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切突变基因xynED和xynMA,1.0%琼脂糖凝胶电泳酶切产物并割胶回收,分别与质粒pET-28a连接,构建表达载体pET-28a-xynED以及pET-28a-xynMA,转化E.coliBL21(DE3),经Kan抗性筛选出阳性单克隆菌落。

1.5重组木聚糖酶基因诱导表达

将重组菌分别过夜培养,以1/50的接种量分别接种于含Kan的LB液体培养基中,培养至A600为0.6时,加入终浓度为2 mmol/L的IPTG,诱导2 h,培养条件为37 ℃、230 r/min,离心菌体,加入柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 4.6)缓冲液,超声波破碎离心得到上清粗酶液。

1.6重组木聚糖酶纯化

采用5 mL镍金属螯合层析柱对含有His标签蛋白的重组木聚糖酶XynZF-2和XynMA进行纯化,并采用15%分离胶和5%浓缩胶,SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化后的重组蛋白XynZF-2和XynMA,具体方法见参考文献[11]。

1.7重组木聚糖酶活性测定

采用DNS法测定木聚糖酶活性[11]。1.5 mL 0.5%桦木木聚糖溶液加入1 mL酶液,在40 ℃条件下反应15 min,加入DNS立即终止反应,沸水浴7 min显色,冷却后加入5 mL蒸馏水,测定A540。在以上条件下,以每分钟产生1 μmol还原糖所需的酶量定义为1个单位(U)。

1.8重组木聚糖酶酶学性质测定

在35～60 ℃水浴条件下,每隔5 ℃,反应15 min,按1.7方法测定重组木聚糖酶酶活性。以最高酶活性为100%计算各个温度下重组木聚糖酶的相对酶活性,作出温度-相对酶活性曲线。将酶液在40 ℃和45 ℃条件下,保温0～60 min,每隔5 min取样,测定残余酶活性,以未保温的酶液酶活性为100%,数据具体处理方法见参考文献[11]。

2　结果与分析

2.1同源序列比对建模及突变位点确定

同源建模发现,木聚糖酶XynZF-2由一个简单的α-螺旋以及两个反向的β-折叠片层组成,呈右手半握状结构,属于GH11家族(图1)。通过木聚糖酶XynZF-2活性中心预测分析发现,第103、194位点的谷氨酸位于底物与酶相互作用的中心位点。为证实催化活性中心预测的正确性,根据氨基酸相似性以及大肠杆菌密码子偏爱性,将第103、194位点的谷氨酸分别替换成天冬氨酸。利用DS ViewerPro6.0分析木聚糖酶XynZF-2疏水作用集群以及氨基酸序列发现,在α-螺旋处出现疏水集群见图1(蓝色标记为疏水性氨基酸残基)并且远离活性中心位点。因此,定点突变α-螺旋顶端位点(K178M、G180A)以及附近位点(V125A),增强疏水作用,期望提高该酶的热稳定性(图2)。

图1　木聚糖酶XynZF-2结构Fig.1　The structure of the XynZF-2

图2　杂合木聚糖酶结构Fig.2　The structure of the hybrid xylanase

2.2定点突变

以重组质粒pET-28a-xynZF-2为模板,PCR扩增突变基因xynED和xynMA,TA克隆转化大肠杆菌JM109,经蓝白斑筛选以及测序发现突变位点与设计位点一致。

2.3木聚糖酶重组表达载体的构建

限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切突变基因xynED、xynMA和质粒pET-28a连接,构建表达载体pET-28a-xynED以及pET-28a-xynMA,转化E.coliBL21(DE3),经Kan抗性筛选,用于后续表达。

2.4重组木聚糖酶的表达以及纯化

2.4.1重组木聚糖酶XynED的诱导表达按1.5木聚糖酶诱导表达方法,诱导重组木聚糖酶XynED和XynZF-2,超声波破碎提取粗酶液,按1.7酶活性测定方法测定XynED和XynZF-2酶活性,发现突变酶XynED酶活性为原酶XynZF-2的0.17%。SDS-PAGE蛋白电泳(图3)检测发现,诱导的XynED和XynZF-2在25～35 ku处有明显条带,而经IPTG诱导的重组菌BL21/pET-28a、未诱导的XynED和XynZF-2条带相对较浅,说明突变酶XynED在大肠杆菌BL21中得到很好的表达。由此推断第103、194位点谷氨酸为木聚糖酶XynZF-2的活性中心关键氨基酸。

2.4.1重组木聚糖酶XynMA的表达和纯化按1.5方法诱导表达重组木聚糖酶XynMA和XynZF-2,超声波破碎提取粗酶液,并通过镍金属螯合亲和层析柱对重组木聚糖酶XynMA和XynZF-2进行纯化,SDS-PAGE电泳检测(图4)。由图4可见,重组木聚糖酶XynMA和XynZF-2相对分子质量一致,纯化的蛋白样品电泳后每条泳道仅有一条带,说明纯度较高,达到了电泳纯,基本满足生物催化和酶学性质分析。

图4　重组木聚糖酶XynMA和XynZF-2 SDS-PAGE电泳Fig.4　SDS-PAGE analysis of the recombinant xylanase XynMA and XynZF-2注:M:蛋白质Marker;1:纯化后的木聚糖酶XynMA;2:纯化后的木聚糖酶XynZF-2。

2.5重组木聚糖酶最适温度及热稳定性的比较分析

图5　重组木聚糖酶XynMA和XynZF-2最适温度的比较Fig.5　Comparison of the optimum temperature between the recombinant xylanase XynMA and XynZF-2

图6　重组木聚糖酶XynMA和XynZF-2热稳定性比较Fig.6　Comparison of the thermostability between the recombinant xylanase XynMA and XynZF-2

3　结论与讨论

木聚糖酶作为一种重要的工业酶,广泛应用于工业生产的各个领域[15]。大多数应用领域需要耐热且具有高比活性的木聚糖酶。目前,主要由两种途径得到耐热性木聚糖酶:一是对常温高比活性酶进行耐热性分子改造,二是天然耐热酶的筛选[16]。

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Effect of introducing hydrophobic amino acids residues on the thermostability of family GH11 xylanases

LI Tong-biao1,ZHOU Chen-yan1,ZHU Xin-shu1，*,WANG Dan-dan1，2

(School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University,Xinxiang 45300,Henan Province,China)