他克莫司局部缓释用药对大鼠胫神经损伤的疗效

冯思航，冯登殿，赵炜疆



·论著·

他克莫司局部缓释用药对大鼠胫神经损伤的疗效

冯思航1，冯登殿2，赵炜疆1

目的：观察大鼠胫神经损伤后局部短暂应用他克莫司（FK506）纳米微球缓释颗粒对神经再生的影响。方法：Wistar大鼠36只，随机分为实验组（n=24）和对照组（n=12），实验组根据释放用药时间不同分为10 d亚组和15 d亚组各12只，建立左侧胫神经切断的端端缝合模型。于术后2周、3周分别取缝合口远侧端神经干进行变性轴索、变性髓鞘染色，观察其变性轴索、变性髓鞘、再生髓鞘纤维数。结果：术后2、3周，实验组缝合口远侧端神经干内变性轴索数少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；变性髓鞘数少于对照组，有显著性差异（P<0.01）。术后3周，10 d亚组髓鞘数多于 15 d亚组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：局部短暂少量应用FK506纳米微球缓释颗粒，能缩短损伤远侧端神经溃变时间，利于药物充分吸收，减少用药部位结缔组织对局部药物缓释时的影响。

他克莫司；纳米微球；变性神经纤维；神经再生；大鼠

周围神经损伤后其远端的轴索、髓鞘会发生Wallerian变性[1,2]，如何较客观地反映神经损伤和评价损伤后神经再生，寻找促进神经再生的药物，优化损伤神经修复时间是相关药物研发的重点。目前已发现许多能促进神经再生、增加肌重量和促进肌张力恢复的物质，如神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、脑源性神经营养因子（brain derived neurophic factor，BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）、单胺抑制剂等[3-5]。他克莫司（Tacrolimus，FK506）作为一种新型大环内酯类抗生素，具有高效免疫抑制作用[6]，被用于异体神经移植后促神经再生，其疗效已得到肯定。但自体神经损伤后局部应用FK506促进神经再生的恢复效果仍存在争议[7,8]，有待进一步研究。本研究在大鼠胫神经切断的端端缝合模型中应用FK506纳米微球，采用已证明可加速大鼠神经再生的释放率的给药剂量[1mg/(kg·d)][9]，并选择不同的释放时间，用变性神经髓鞘和变性轴索特异性染色，结合髓鞘和HE染色，对照观察神经端端缝合术后Wallerian变性改变，分析该药物对神经再生的作用，为神经再生创造良好微环境提供合理的依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 雄性Wistar大鼠36只，体质量180～220 g，购自南方医科大学动物中心，随机分为实验组（n=24）和对照组（n=12），实验组根据不同释放用药时间分为10 d亚组和15 d亚组各12只。1.1.2主要试剂与仪器FK506纳米微球（由中山大学高分子材料实验室提供）；髓鞘染色剂（Luxol快蓝MBS）、硝酸银（购于上海化学试剂公司）；HMIAS-2000型图像分析仪（购于武汉千屏影像公司）；SXP-LB手术显微镜（购于上海医用光学仪器厂）；CM1900恒冷箱切片机（购于德国Leica公司）。

1.2方法

1.2.1模型制备及给药 腹腔注射0.4%戊巴比妥钠1 mL/kg麻醉大鼠，取左肢后外侧中部纵形切口，在手术显微镜下暴露出坐骨神经，在梨状肌下缘10 mm处，在放大10倍的手术显微镜下分离出胫神经，并切断胫神经，再用11-0无创尼龙针线行神经外膜缝合术，缝合4针。实验组在缝合口周围放置FK506纳米微球，10 d亚组和15 d亚组的用药量按释放率 1mg/ (kg·d)释放10 d和15 d，对照组不给药，依次缝合。

1.2.2标本取材与检测 实验组10 d亚组、15 d亚组和对照组各于术后2、3周时处死6只大鼠。0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，生理盐水经心脏主动脉灌注冲洗后，4%多聚甲醛0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）灌注后固定2 h。在缝合口远侧取5 mm长的神经段置于20%蔗糖内4℃冰箱内过夜，然后置于恒冷箱切片机行横断切片，片厚15 μm，贴于铬钒明胶玻片上，行Nauta和Gygax氏变性神经纤维银浸法染色、Marcji变性髓鞘锇酸染色（冰冻切片）。相邻切片按Kluver和Barrera氏Luxol快蓝MBS髓鞘染色法染色和HE染色。

1.2.3神经纤维图像分析 使用光学显微镜和HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统，分别计算变性神经髓鞘、变性轴突、再生髓鞘数目。

1.3统计学处理

采用SPSS10.0统计软件分析数据，计量结果以（均数±标准差）表示，独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1轴索变性纤维染色

变性神经纤维轴索呈黑色，底浅黄色，正常纤维无色，相差显微镜下神经纤维轮廓可辩认。2组均有散在的变性神经纤维，术后2周时，2组均有较多的点状、条索状变性纤维，排列不整齐（图1A、B）；术后3周时2组变性轴索明显减少，呈点状散在分布，近神经干边缘明显（图1C、D）。术后2、3周，实验组10 d亚组和15 d亚组中，变性神经纤维轴索数均少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；10 d亚组与15 d亚组相比，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

图1　2组术后2、3周轴索变性观察（Nauta和Gygax氏变性神经纤维银浸染色，×200）

表1　2组胫神经远侧端变性轴索计数（根，）

表1　2组胫神经远侧端变性轴索计数（根，）

注：与对照组比较，①P<0.05

组别 只数 术后2周 术后3周对照组　6　1 098.00±31.91　495.16±57.32实验组10 d亚组　6　1 038.67±45.83①　409.50±49.65①15 d亚组　6　1 026.67±61.21①　418.83±63.27①

2.2髓鞘变性纤维染色

术后2周时，实验组10 d亚组和15 d亚组及对照组有散在的变性髓鞘（图2A、B）；15 d亚组靠近缝合口处神经内髓鞘崩解严重，出现许多髓鞘碎片，底呈淡黄色，正常髓鞘无色（图2C）；术后3周时，15 d亚组的变性髓鞘仍然存在，但明显减少，且见远侧端神经内有大量外形完整的变性髓鞘（图2D）。术后各时间点，实验组10 d亚组和15 d亚组变性髓鞘数均少于对照组，有显著性差异（P<0.01）；10 d亚组与15 d亚组相比，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.3快蓝染色

相邻片不着色区为均匀有序的有髓神经纤维，其内夹杂有排列欠整齐的有髓神经纤维，并且出现着色程度不同，深染和淡染髓鞘同时存在（图3A、B）。术后各时间点，实验组10 d亚组和15 d亚组髓鞘数均多于对照组，有显著性差异（P<0.01）；术后2周，10 d亚组与15 d亚组相比，髓鞘数差异无统计学意义（P>0.05）；术后3周，10 d亚组髓鞘数多于15 d亚组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

图2　实验组髓鞘变性纤维染色（Marcji变性髓鞘锇酸染色）

表2　2组胫神经远侧端变性髓鞘计数（根，）

表2　2组胫神经远侧端变性髓鞘计数（根，）

注：与对照组比较，①P<0.01

组别 只数 术后2周 术后3周对照组　6　558.83±50.04　391.16±32.21实验组10 d亚组　6　440.67±29.61①　290.33±34.06①15 d亚组　6　470.67±49.45①　307.33±42.36①

图3　术后10 d亚组髓鞘观察（Kluver和Barrera氏Luxol快蓝MBS髓鞘染色，×400）

表3　2组胫神经远侧端髓鞘计数（根，）

表3　2组胫神经远侧端髓鞘计数（根，）

注：与对照组比较，①P<0.01；与15 d亚组比较，②P<0.05

组别 样本数 术后2周 术后3周对照组　6　1 901.17±33.85　2 021.83±46.76实验组10 d亚组　6　2 000.83±54.04①　2 209.17±35.50①②15 d亚组　6　2 024.66±58.86①　2 144.50±60.80①

2.4HE染色

实验组10 d亚组神经周围未见明显未溶解吸收药物的结节状病灶，结缔组织形成少（图4A）；15 d亚组有明显未溶解吸收药物的结节状病灶，结缔组织形成较多（图4B）。

图4　术后3周实验组神经观察（HE染色，×100）

3　讨论

3.1神经溃变与促神经再生药效的细胞化学观察

英国生理学家Waller早在1850年就发现周围神经切断后，其神经远端就会由近及远直至神经末端会出现顺行性溃变。远段神经发生溃变以后，近端神经又能由近及远的向溃变远端神经内生长，以1 mm/d的速度爬行到达终末器官，称Wallerian溃变或Wallerian变性[1,2]。已知外周神经元分化成熟后不具备分裂增殖能力，只有在神经损伤时才出现分裂增殖，由静态相进入增殖相，且已证实周围神经损伤后具备再生能力。神经溃变纤维检测被视为反映神经再生的病理形态学重要指标，故本研究采用变性神经纤维染色的方法，结合快蓝染色法作为阳性对照，能较直观地识别溃变神经和正常神经组织，检测神经再生的质量。结果表明，实验组在缝合口远侧段端的神经干内，均有数量不等的溃变神经纤维，对照组中神经干内溃变轴索呈点状、条索状分布，尤其在神经干边缘和靠近缝合口附近纤维排列不整齐，可能与神经缝合时与神经扭曲成角有关。术后2、3周实验组的缝合口远侧端神经干内溃变轴索数和溃变髓鞘纤维数少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。术后3周10 d亚组和15 d亚组内都出现许多新生髓鞘，提示局部早期短时间应用FK506纳米微球对神经轴索生长有一定促进作用。在实验中除见到神经缝合口远侧端有较多的散在或不均匀分布的溃变纤维外，其内仍存在大量不着色的神经纤维，相邻片髓鞘染色证实该不着色区域为深染的有髓神经纤维成分，是正常的髓鞘纤维，提示它们是神经损伤断端朗飞结处出现的许多神经枝芽快速生长，跨过缝合口长到或要抵达靶肌肉内的再生的神经髓鞘和轴索[10,11]。

3.2局部缓释用药与神经再生微环境之间组织理化分析

变性神经染色结果提示，10 d亚组的FK506纳米材料能加速神经损伤后变性、崩解神经纤维被巨噬细胞等吞噬过程，促进近端轴索向远端段再生，局部用药区域进行HE染色可观察到缝合口神经周围局部炎性反应较轻，纤维组织较少，利于组织对药物在有限的时间内降解，既能保证局部药物的浓度，又可实现类似缓释作用，然而，15 d亚组出现局部尚未溶解吸收缓释药物引起的新生毛细血管和纤维母细胞组成的肉芽组织，长入药物内并进行“异物性”包裹的病理现象。较早研究报道发现，短暂应用FK506，能促进神经在解剖及生理功能的恢复。实验证实FK506剂量1 mg/(kg·d)可加速大鼠神经再生[8]，且早期给药效果明显[12]，这与本研究结果基本一致。这提示在能充分满足神经生长所需要的时间前提下，要考虑短时间内药物能否充分吸收，以及机体自身免疫防御、免疫监视的反应，防止局部较多结缔组织形成，使降解停止，起不到缓释给药作用，达不到缓释目的。其体内降解值变成局部缓释虚拟值，会直接或间接地改变局部促进神经生长理化微环境，影响和干扰神经再生。药物在体内的缓释量和缓释时间受到体内防御体系的影响，降解产物除具有良好的生物安全性、组织相容性以外，局部用药时要高度重视体外降解质量和影响体内降解率的这些汇合因素，否则在同一释放率不同时间段出现随神经变性时间延长而使神经再生效果变差。同时，本研究还表明，采用变性神经染色方法反映神经再生病理形态指标，也是评价神经再生的一个重要参考。

总之，周围神经再生与修复的研究甚多，得出了很多有提示意义的实验结果。已知FK506对自体神经再生和修复有促进作用，但其具体机制仍有待明确。如何预防远端神经失神经变性，仍然是促进神经再生、功能恢复的主要突破点[13]。

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[13]Lehmann HC,Hoke A.Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2010,9: 801-806.

（本文编辑：王晶）

Effects of FK506 Microspheres on the Tibial Nerve Injury in Rats

FENG Si-hang1,FENG Deng-dian2,ZHAO Wei-jiang1.1.Neuroscicence Center,Shantou University Medical College,Guangdong 515041,China;2. Central Lab,Shajin Renmin Hospital,Guangzhou Medical University,Guangdong 518104,China

Objective:To observe the effects of the brief local application of FK506 by P(DLLA-co-TMC)microspheres on nerve regeneration in rats with tibial nerve injury.Methods:An end-to-end neurorrhaphy model for the left tibial nerve repair was established in 36 Wistar rats that were randomly divided into the experimental group (n=24)and control group(n=12).The experimental group was further divided into subgroups 10 and 15 d based on the duration of drug delivery.At postoperative weeks 2 and 3,axonal staining,myelin staining,and HE staining were performed on the degenerated nerve stems in the distal stumps to observe the degeneration of the axons and sheaths,and the number of the regenerated axonal nerve fibers.Factors that affect the local drug delivery were also evaluated.Results:At weeks 2 and 3,the numbers of the degenerated axons in the distal stumps were fewer in the experimental group than those in the control groups(P<0.05),and the numbers of degenerated sheaths were also significantly fewer in the experimental group than those in the control group(P<0.01).At week 3,the 10 d subgroup showed significantly more sheaths than those in 15 d subgroup(P<0.05).Conclusion:Brief local application of FK506 by P(DLLA-co-TMC)microspheres can slow down the degeneration of nerve axons,by promoting the complete absorption of the drug,and reducing the interference of the connective tissues during drug delivery.

FK506;microspheres;degenerated nerve fiber;nerve regeneration;rat

R741;R741.05

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.010

1.汕头大学医学院神经科学中心

广东汕头515041 2.广州医科大学深圳沙井人民医院中心实验室

广东深圳518104基金项目

国家自然科学基金（No.81171138,814 71279）

2015-08-19

赵炜疆

neuromancn@

aliyun.com