调节性T细胞及相关细胞因子在慢性髓系白血病中的变化

陈曦希，杨明珍，夏瑞祥



调节性T细胞及相关细胞因子在慢性髓系白血病中的变化

陈曦希，杨明珍，夏瑞祥

目的 探讨未治和经治慢性髓系白血病（CML）患者外周血中调节性T细胞（Treg）及其相关细胞因子的变化。方法 流式细胞术检测CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞占CD4+T细胞的比例，ELISA法检测白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和白介素-35（IL-35）的血浆浓度。结果 初诊组、复查组和对照组间Treg细胞比例和血浆IL-10浓度差异无统计学意义。初诊组的血浆TGF-β1和IL-35浓度显著高于复查组和对照组（P＜0.001）；复查组和对照组间差异无统计学意义。结论 初诊CML患者的TGF-β1和IL-35水平升高，表明其在疾病的进展中发挥重要作用，并可能有判断疗效的价值。

慢性髓系白血病；调节性T细胞；转化生长因子-β；白介素-35；肿瘤免疫

网络出版时间：2016-6-6 13：52：32 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.042.html

慢性髓系白血病（chronicmyelocyticleukemia，CML）是一种发生在造血干细胞上的克隆性骨髓增殖性疾病，以9号染色体和22号染色体易位形成BCR-ABL融合基因为特征，该基因编码的蛋白（p210，分子量为210 ku）有异常的酪氨酸激酶活性，在CML的发病中发挥重要作用［1］。临床上CML分为慢性期、加速期和急变期。靶向药物酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是目前治疗CML的首选用药。尽管研究［2］表明CML是一种有免疫原性的血液系统恶性肿瘤，但是大多数CML患者并不能建立有效的抗肿瘤免疫应答。这可能是由抑制抗肿瘤免疫应答的因素所致。近年来，调节性T细胞（Treg）在肿瘤免疫中的作用获得广泛关注。Treg细胞负性调节免疫应答。在正常小鼠和人类，Treg细胞占外周血CD4+T细胞的5%～10%［2-5］。而在肿瘤患者，异常增高的Treg细胞可能抑制抗肿瘤免疫应答，加速肿瘤进展。分泌免疫抑制性细胞因子是Treg细胞发挥作用的主要途径［4］，如白介素-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和白介素-35（interleukin-35，IL-35）。由于CML是最容易受免疫治疗影响的恶性肿瘤之一［1］，调控Treg细胞及其相关细胞因子表达可能成为CML治疗的新手段。但是对Treg细胞及其相关细胞因子在CML中的作用了解甚少。该研究通过检测CML患者外周血中Treg细胞及其相关细胞因子的水平，探究其在CML中的表达和临床意义。

1　材料与方法

1.1病例资料 收集2015年1月～2015年9月就诊于安徽医科大学第一附属医院血液科的50例成年CML患者。30例为初诊未治患者（初诊组，其中慢性期25例、加速期4例、急变期1例），男19例，女11例，年龄21～75岁，中位年龄47岁。另20例为TKI治疗过程中的复查患者（复查组，BCR-ABL 210转录本水平均已降至10%以下），男13例，女7例；年龄21～75岁，中位年龄45岁。诊断和分期符合《中国慢性髓系白血病诊断与治疗指南（2011年版）》［6］。以我院20例健康体检者为对照组，男10例，女10例；年龄23～72岁，中位年龄47岁。对照组无肿瘤、自身免疫性疾病及炎症性疾病。初诊组、复查组与对照组之间年龄和性别差异无统计学意义。

1.2试剂和仪器 鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PC5及同型对照抗体、红细胞裂解剂、磷酸盐缓冲液（PBS）及NAVIOS流式细胞仪均购自美国Beckman Coulter公司；ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3标本采集 采集CML患者和健康体检者的晨起空腹外周血6 ml，置于肝素钠抗凝真空采集管，轻轻混匀。标本分两部分处理：一部分立即送至实验室，进行CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞检测；另一部分以2 000 r/min离心5 min分离血浆，置于EP管并冻存于-80℃冰箱，备用于细胞因子检测。

1.4流式细胞仪检测Treg细胞比例 取流式上样管，加入10μl CD25-PC5、20 μl CD4-FITC、20 μl CD127-PE，再加入肝素钠抗凝全血100 μl（同时设同型对照），混匀，4℃避光孵育20 min。加入1 ml红细胞裂解剂，混匀，避光放置10 min。1 500 r/min离心5 min，弃上清液。用PBS洗涤后上流式细胞仪检测。每管收集30 000个细胞。在前向角散射（FSC）—侧向角散射（SSC）散点图上圈定淋巴细胞群，再以CD4和SSC设门选择CD4+细胞，分析CD25和CD127表达，计算CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞占CD4+T细胞的比例。应用Navios tetra软件分析数据。

1.5ELISA法检测血浆细胞因子浓度 采用ELISA法测定血浆IL-10、IL-35和TGF-β1浓度。严格按照试剂盒说明书进行操作。每份样本测定3孔，用酶标仪检测每个测试孔的吸光度（optical density，OD）值，计算平均浓度。

1.6统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行分析，符合正态分布的定量资料以±s表示；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；不符合正态分布的定量资料以中位数和四分位间距［M（Q25，Q75）］表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，进一步两两比较采用扩展的t检验法。

2　结果

2.1CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞占CD4+T细胞比例初诊组、复查组和对照组CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞占CD4+T细胞比例差异无统计学意义（F=2.983，P＞0.05），但初诊组CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞占CD4+T细胞比例［（6.34±1.97）%］略低于复查组［（6.41± 2.07）%］和对照组［（7.58±1.48）%］趋势，见图1。

2.2血浆IL-10浓度 血浆IL-10浓度在初诊组、复查组和对照组间的差异无统计学意义（H= 4.273，P＞0.05），见表1。初诊组的血浆IL-10浓度略低于复查组和对照组。

2.3血浆TGF-β1浓度 初诊组、复查组和对照组的血浆TGF-β1浓度差异有统计学意义（H= 31.642，P＜0.001）。其中，初诊组的血浆TGF-β1浓度显著高于复查组（t=6.725，P＜0.001）和对照组（t=5.801，P＜0.001）。复查组和对照组差异无统计学意义（t=0.843，P＞0.05），见表1。

2.4血浆IL-35浓度 血浆IL-35浓度在初诊组、复查组和对照组的差异有统计学意义（H=24.644，P＜0.001）。进一步两两比较结果显示，初诊组的血浆IL-35浓度显著高于复查组（t=5.227，P＜0.001）和对照组（t=4.975，P＜0.001）。复查组和对照组差异无统计学意义（t=0.229，P＞0.05），见表1。

图1　CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞占CD4+T细胞比例流式图

3　讨论

Treg细胞负性调节免疫应答。异常增高的Treg细胞可能抑制肿瘤特异性免疫应答，使肿瘤细胞能够逃避免疫监视，从而加速肿瘤进展［2］。一般认为，分泌免疫抑制性细胞因子是Treg细胞发挥作用的主要途径［4］。其中，IL-10、TGF-β1和IL-35是最重要的细胞因子。

表1　Treg细胞相关细胞因子的血浆浓度［M（Q25，Q75）］

研究［3］显示，CD4+CD25hig hFOXP3+Treg细胞在多种实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤患者的肿瘤组织或外周血中比例升高，与疾病预后不良及进展有关。Rojas et al［5］发现，高表达BCR-ABL的CML患者的CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例升高。Zahran et al［2］的研究也表明，初诊CML患者的CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞比例显著高于健康对照组；加速期和急变期患者高于慢性期患者；治疗后获得完全分子学缓解的患者显著低于治疗前。但是，当采用不同的分子标记Treg细胞时，结果可能截然不同。CML慢性期未治疗患者和加速急变期患者的CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞占外周血单个核细胞比例显著低于慢性期治疗患者和健康对照者［7］。本研究同样以CD4+、CD25high和CD127low/-为标志物，检测了CML患者外周血中Treg细胞水平。结果显示初诊组与复查组的外周血CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞占CD4+细胞比例的差异无统计学意义。在 70份样本中，CD4+CD25highCD127low/-Treg细胞比例的最低值来自于唯一的急变期患者，仅1.2%。截然不同的研究结果可能是由对Treg细胞的标记不同或者样本量偏小导致。目前对于CD4+CD25+CD127low/-Treg细胞和CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞究竟是不是同一细胞尚无定论，对于如何定义和标志Treg细胞也没有统一标准。因此，需要在扩大样本量的基础上明确标志物不同对检测CML患者外周血Treg细胞比例的影响。

IL-10和TGF-β在体内的免疫抑制作用已经在多种实验模型上得到证实［4］。但是，在本研究中，血浆IL-10浓度在3组间未见差异有统计学意义。IL-10是一种多细胞源的细胞因子。因此，血浆IL-10水平可能难以反映CML患者体内Treg细胞功能的变化。TGF-β也是一种多细胞源的多功能细胞因子。研究［7］表明，CML肿瘤干细胞中的BCR-ABL肿瘤蛋白诱导TGF-β1产生，后者激活PI3K-Akt-NF-κB信号转导通路。该通路的活化增加了基质金属蛋白酶9（MMP-9）的产生，从而促进可溶性Kit配体（s-KitL）和细胞间黏附分子1（s-ICAM-1）的合成。异常增高的MMP-9会降解细胞外基质；s-ICAM-1合成增加能够保护白血病细胞免受T淋巴细胞和NK细胞识别，s-KitL合成增加能够动员CML细胞释放至外周循环［8］。因此，TGF-β1可能促进CML进展。此外，TGF-β1还通过 PI3K-Akt-FoxO信号通路维持CML肿瘤干细胞的干细胞样特性和致瘤活性［9］。本研究的结果显示，初诊组的血浆TGF-β1浓度显著高于复查组和对照组，而复查组和对照组之间差异无统计学意义。这表明检测血浆TGF-β1浓度可能有评价疗效的价值。

IL-35是新近发现的抑制性细胞因子，主要由活化的Treg细胞分泌［10］。IL-35不仅强效抑制T细胞增殖［11］，还能够诱导初始T细胞转变为一种有免疫抑制作用的调节性T细胞（iTr35），形成“传染性耐受”，将抑制活性最大化［10，12-13］。本研究初诊组的血浆IL-35浓度显著高于复查组和对照组，而复查组和对照组之间差异无统计学意义。考虑到初诊组的Treg细胞比例与复查组和对照组比较差异无统计学意义，而主要由Treg细胞分泌的IL-35水平显著升高，可以推测CML患者体内存在Treg细胞功能异常。确切的结果需要进一步的体外细胞功能测定研究。但是，研究［14］显示IL-35过度表达能够抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤活性。因此，IL-35对于不同肿瘤可能作用不同。IL-35在CML中的作用有待进一步研究。

综上所述，本研究通过检测外周血中Treg细胞及其相关细胞因子的水平，表明初诊CML患者的TGF-β1和IL-35水平显著升高，与机体细胞免疫功能紊乱可能互为因果。尚需进一步研究明确Treg细胞的功能状态以及TGF-β1和IL-35在疾病发生、发展中的具体作用，联合TKI类药物，对其进行调控可能是治疗CML的新方法。

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Changes of regulatory T cells and their associated cytokines in patients with chronic myeloid leukemia

Chen Xixi，Yang Mingzhen，Xia Ruixiang
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the changes in the proportion of regulatory T（Treg）cells and in the levels of cytokines secreted by these cells in the peripheral blood in the patients with chronic myeloid leukemia（CML）. Methods The enrolled subjects consisted of 30 CML patients who were newly diagnosed，20 CML patients who were under the effective treatment of tyrosine kinase inhibitors（BCR-ABL 210 transcript ratio is below 10%）and 20 healthy donors whose age and sex were matched.Flow cytometry was used to detect CD4+CD25highCD127low/-Treg cells and CD4+T cells.The enzyme linked immunosorbent assay was used to determine the plasma concentrations of interleukin-10（IL-10），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and IL-35.Results The proportions of Treg cells in CD4+T cells were similar among the three groups.As concerns the three kinds of Treg-associated cytokines，there were no significant differences in the plasma concentrations of IL-10 among the three groups.However，compared with the treatment group and the control group，the plasma concentrations of TGF-β1 and IL-35 in the newly diagnosed patients significantly increased（P＜0.001），with no significant difference between the treatment group and the control group.Conclusion Though the proportion of Treg cells did not significantly change in the newly diagnosed patients，the plasma concentrations of TGF-β1 and IL-35 indeed significantly enhanced，suggesting the dysfunction of Treg cells in the newly diagnosed patients might be associated with the progression of disease.Effective treatment of tyrosine kinase inhibitors could down-regulate the plasma levels of these cytokines to baseline，suggesting that monitoring these cytokines might evaluate the efficacy of therapy.

chronic myeloid leukemia；regulatory T cells；transforming growth factor-β；interleukin-35；tumor immunity

R 557+.3

A

1000-1492（2016）07-1015-04

2016-04-22接收

安徽省科技攻关项目（编号：11010402168）

安徽医科大学第一附属医院血液科，合肥 230022

陈曦希，女，硕士研究生；杨明珍，男，教授，主任医师，硕士生导师，E-mail：yangmz89@163.com.cn；夏瑞祥，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：xrx2041@163.com