HPV16 E5、E6和E7基因重组慢病毒载体的构建及其感染口腔上皮细胞

项先旺，江 彤，陈传俊，3



HPV16 E5、E6和E7基因重组慢病毒载体的构建及其感染口腔上皮细胞

项先旺1，江 彤2，陈传俊1，3

目的 分别构建HPV16 E5、E6和E7癌基因的重组慢病毒载体感染人口腔上皮细胞，为研究E5基因对口腔上皮细胞的致癌机制奠定基础。方法 克隆HPV16 E5、E6和E7基因，分别构建pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7重组慢病毒载体，与包装质粒共转染293T细胞。收集3种慢病毒上清液，分别感染口腔上皮细胞、腺嘌呤素筛选感染细胞，RT-PCR和Western blot法检测目的基因的表达。结果 成功构建pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFPE6和pLVX-AcGFP-E7重组慢病毒载体，获得3种慢病毒上清液，筛选得到3个稳定的细胞株。RT-PCR和Western blot均可检测到HPV16 E5、E6和E7基因在口腔上皮细胞内表达。结论 本研究构建的3个重组慢病毒载体能成功感染口腔上皮细胞。

人乳头状瘤病毒；HPV16癌基因；慢病毒载体；口腔上皮细胞

网络出版时间：2016-6-6 13：52：31 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.010.html

人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是宫颈癌发生的主要致病因子。大量的流行病学调查资料显示，HPV也与口腔癌的发生密切相关［1-2］。目前关于HPV与口腔癌关系的研究主要集中于对高危型HPV E6和E7基因的研究，它们都可与肿瘤抑制物结合并使其失活［3］。实际上，HPV E5基因有其特殊的生物活性，与肿瘤的发生关系同样非常密切。E5基因可抑制细胞的凋亡，导致细胞周期异常，甚至还能增强E6和E7基因对细胞的恶性转化作用［4-5］。Schiffman et al［6］比较不同型别HPV全基因组序列发现，有生物活性的E5基因总是存在于引起恶性肿瘤的高危型HPV基因组中，说明E5基因在HPV致癌过程中可能发挥着至关重要的作用。因此，深入研究HPV E5基因的功能及其致癌性，可能是进一步了解HPV致癌机制的重要突破口。该研究拟构建HPV16 E5、E6和E7基因重组慢病毒载体，感染口腔上皮细胞，以期为研究高危型HPV E5基因在口腔上皮细胞癌的致病机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样本采集 感染HPV16的口腔癌病理标本由本实验室保存，取自临床肿瘤组织；无菌口腔黏膜标本则取自安徽医科大学第三附属医院小儿唇腭裂术中多余上皮。

1.1.2菌种及载体 大肠杆菌DH5α由本实验室保存；克隆载体pGEM-Teasy Vector购自美国Promega公司；慢病毒核心质粒pLVX-AcGFP-N1购自上海吉凯公司；慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2G购自美国Addgen公司。

1.1.3酶与试剂 反转录试剂盒、各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser等工具酶均购自日本TaKaRa公司；脂质体Lipofectamine 2000、无血清培养基Defined Keratinocyte-SFM、分散酶DispaseⅡ、嘌呤霉素购自美国Life Technologies公司；293T细胞购自美国ATCC公司；质粒抽提试剂盒购自美国OMEGA公司；一抗（Mouse Anti-GFP）、二抗（Goat Anti Mouse）、hexadimethrine bromide、DMEM、胎牛血清购自美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1HPV16 E5、E6和E7基因的克隆及3个慢病毒载体的构建 根据本实验室已报道的HPV16 （GenBank登录号：KC935953）序列，分别设计扩增E5、E6和E7特异性引物，见表1。上游引物5′端引入EcoR I位点，下游引物5′端引入BamH I位点。提取感染HPV16肿瘤标本的总DNA，PCR扩增条件为：94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 14 s，30个循环。PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段。EcoR I和BamH I双酶切纯化的目的片段，与同样双酶切的慢病毒载体pLVX-AcGFP-N1连接，转化大肠杆菌DH5α。PCR筛选阳性克隆，测序验证重组慢病毒载体 pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7携带的E5、E6和E7基因序列是否发生突变。

表1　引物序列

1.2.2重组慢病毒的包装 分别将3个重组质粒与包装质粒psPAX2和pMD2G共转染293T细胞，48 h后收集病毒上清液，浓缩后分装保存于-80℃冰箱。

1.2.33种慢病毒滴度测定 逐步稀释法测定3种慢病毒滴度，分别在96孔板中接种293T细胞，第2天用完全培养基按（1～10-9）10个梯度稀释病毒液，每孔加入100 μl稀释后的病毒液，每个梯度设置3个重复；48 h后观察细胞中GFP的表达，若10-8梯度孔中分别有2、3和4个细胞GFP（+），则取平均值，此病毒滴度为3×108TU/ml。

1.2.4口腔上皮细胞的原代及传代培养 将无菌口腔黏膜标本置于2 mg/ml DispaseⅡ中，4℃消化过夜。次日，用眼科镊分离获取上皮层并用剪刀将其剪成1 mm×1 mm大小，胰酶消化10 min，含10%胎牛血清的DMEM中止消化。1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入Defined Keratinocyte-SFM培养基重悬细胞。以1×104个/cm2接种到35 mm的培养皿中，37℃5%CO2培养箱中培养，当细胞铺满瓶底的70%～80%时，按1∶3的比例进行传代培养。

1.2.5获得稳定感染的细胞株 取P1代口腔上皮细胞接种至6孔板，待细胞融合度约70%时，换液，每孔分别加入pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7慢病毒100 μl，并在每孔中加入终浓度为8 μg/ml的ploybrene，隔天换液，加入终浓度为2 μg/ml嘌呤霉素，培养2周，即可得到稳定感染的细胞株。

1.2.6RT-PCR检测E5、E6和E7基因mRNA表达水平 分别取pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和 pLVX-AcGFP-E7慢病毒稳定感染的口腔上皮细胞株。各提取细胞总 RNA，反转录 cDNA第一链。以cDNA为模板，RT-PCR检测E5、E6和E7。

1.2.7Western blot检测E5、E6和E7蛋白表达水平 收集稳定感染HPV16 E5、E6和E7基因的口腔上皮细胞株，PBS洗3次，加入细胞裂解液200 μl，冰上孵育3 min；将细胞收集到500 μl EP管中，置于冰上继续裂解20 min，12 000 r/min、4℃离心30 min；加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃变性5 min；取30 μg样品总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，蛋白电转至PVDF膜上；5%脱脂奶粉液封闭2 h，加入Anti-GFP一抗，室温孵育2 h；TBST洗膜4次，再加入二抗，室温孵育1.5 h；TBST洗膜10次，加入新配置的Western blot化学显色剂进行显色，5 min后拍照分析。

2　结果

2.1目的基因的扩增 以感染HPV16肿瘤组织的总DNA为模板，分别用3对特异性引物进行PCR扩增，可以扩增出3条约250、500、300 bp的特异性条带，条带大小与预期结果相符。见图1。

图1　HPV16 E5、E6和E7基因的PCR产物

2.2重组慢病毒载体酶切和测序验证 重组慢病毒载体pLVX-AcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVXAcGFP-E7经双酶切体系验证，酶切片段大小符合理论值。说明插入的E5、E5和E6基因读码框正确。测序进一步验证插入的基因序列未发生突变。见图2。

2.3重组慢病毒滴度的测定 3种慢病毒pLVXAcGFP-E5、pLVX-AcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7分别感染293T细胞，逐步稀释法测定滴度，分别为3 ×108、2×108、2×108TU/ml。

2.4口腔上皮细胞的原代及传代培养 原代培养6～7 d，上皮细胞开始增殖，15～20 d细胞开始融合，融合的口腔上皮细胞为不规则多边形，呈铺路石样结构排列。见图3。

图2　重组慢病毒质粒的EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定

图3　P1代口腔上皮细胞形态

2.5RT-PCR和Western blot检测目的基因的表达 倒置显微镜下观察显示，慢病毒pLVX-AcGFPE5、pLVX-AcGFP-E6和 pLVX-AcGFP-E7转染的口腔上皮细胞均有绿色荧光蛋白表达，说明3种慢病毒均可转染口腔上皮细胞。见图4。RT-PCR检测表明，在转染3种慢病毒的口腔上皮细胞中，均可扩增出特异性条带，大小分别约为250、500、300 bp。见图5。Western blot检测显示，在转染3种慢病毒的口腔上皮细胞中，均检测出特异性条带，大小分别约为37、46、39 kDa，与理论大小相符。上述检测结果表明，E5、E6和E7蛋白在口腔上皮细胞中均能成功表达，见图6。

图4　稳定转染慢病毒的口腔上皮细胞 ×100

图5　稳定转染慢病毒口腔上皮细胞总RNA反转录产物PCR检测

图6　稳定转染慢病毒的口腔上皮细胞Western blot检测GFP表达

3　讨论

Sdek et al［7］利用HPV16 E6和E7基因转染人正常口腔上皮细胞引起永生化，与HPV16在宫颈癌的致病机制不同是他检测到肿瘤抑制物p53上调，提示高危型HPV引起口腔癌的机制可能与宫颈癌不同，但其未做进一步研究，尤其缺乏对HPV16致癌基因E5的研究。本课题组前期研究［8］显示HPV16 E5基因可在一定程度上促进人永生化口腔上皮细胞增殖，并对E6和E7基因mRNA表达量有一定的间接上调作用。值得注意的是，HPV16 E5蛋白分子量为10 ku，是由83个氨基酸构成的疏水性膜联合蛋白，随着后期病毒DNA的整合，E5基因会发生缺失，提示在相关肿瘤形成的早期阶段发挥重要作用［9］。E5蛋白可以与各种膜蛋白发生相互作用，主要与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）结合并增强其活性，诱导细胞过度增生和抑制细胞凋亡，使一系列原癌基因过度表达［10］。动物实验［11］表明注射重组腺病毒HPV16 E5疫苗或细胞毒性T淋巴细胞E5肽和CpG寡核苷酸可显著降低肿瘤的生长。Hu et al［12］证实HPV16 E5蛋白能介导细胞融合，而细胞融合可充分诱导染色体不稳定，从而使癌基因表达和细胞周期异常，导致肿瘤，HPV16 E5与E6和E7共表达时能促进这些双核细胞繁殖，也能增加双核细胞的形成率。研究高危型HPV E5基因对口腔上皮致癌性对口腔癌的防治有重要的指导价值和实践意义。

本实验选用的口腔上皮样本材料来自于小儿唇腭裂术中多余口腔上皮，增殖能力较好，原代口腔上皮细胞可传代培养 4～5代。文献［13］显示随着年龄的增加，口腔上皮细胞传代次数减少，成人的口腔上皮细胞只能传至2～3代。同时本研究也表明P1代和P2代口腔上皮细胞与原代细胞生物学性状接近，后随着传代次数增加，部分细胞形态发生改变，细胞增殖减慢，融合时间延迟，细胞逐渐凋亡。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒为基础发展起来的病毒载体［14-15］。慢病毒核蛋白质前整合复合物有噬核特性，从而使慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均有感染能力，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到稳定持久性表达。其次，慢病毒还有初次感染后即丧失继续感染的能力，有安全性好、不易诱发宿主免疫反应、感染效率高等特点。在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。

本研究选择慢病毒载体，应用分子生物学技术，成功构建了慢病毒载体pLVX-AcGFP-E5、pLVXAcGFP-E6和pLVX-AcGFP-E7，均能感染口腔上皮细胞，RT-PCR和 Western blot均能检测E5、E6和E7蛋白在口腔上皮细胞中表达，为后续3种慢病毒单独感染或共感染口腔上皮细胞，阐明HPV16 E5基因与口腔癌的相关性奠定基础。

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Construction of three lentiviral vectors expressing HPV16 E5，E6 or E7 oncogene and respective infection of oral epithelial cells with the vectors

Xiang Xianwang1，Jiang Tong2，Chen Chuanjun1，3
（1Dept of Oral and Maxillofacial Surgery，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230061；2College of Plant Protection，Anhui Agricultural University，Hefei 230036；3Dept of Stomatology，Wannan Medical College，Wuhu 241002）

Objective To provide the basis for the study of HPV16 E5 gene inthe pathogenesis of oral squamous cell carcinoma by constructing three lentiviral vectors expressing HPV16 E5，E6 or E7 oncogene and transfecting oral epithelial cells with the vectors.Methods HPV16 E5，E6 or E7 oncogene was amplified using PCR and ligated into the lentiviral vector pLVX-AcGFP-N1 respectively to construct vectors pLVX-AcGFP-E5，pLVX-AcGFP-E6 and pLVX-AcGFP-E7，then respectively cotransfected 293T cells with packaging plasmids，viral supernatant was collected to respectively transfect oral epithelial cells.Afterpuromycin screening，oral epithelial cells with HPV 16 E5，E6，or E7 oncogene transfection were constructed，then reverse transcription PCR and western blotassays were performed for verifying HPV16 E5，E6 or E7 expression.Results pLVX-AcGFP-E5，pLVX-AcGFP-E6 and pLVX-AcGFP-E7 were successfully constructed，oral epithelial cells expressing HPV 16 E5，E6 or E7 oncogene wereacquired，HPV16 E5，E6 or E7 expression was confirmed in oral epithelial cellsthrough reverse transcription PCR and western blot assays.Conclusion Three lentiviral vectors expressing HPV16 E5，E6 or E7 oncogene can successfully infect oral epithelial cells.

human papillomavirus；HPV16 oncogene；lentiviral vector；oral epithelial cells

R 739.8

A

1000-1492（2016）07-0940-05

2016-03-08接收

国家自然科学基金资助项目（编号：81172574）；皖南医学院人才引进科研启动基金资助

1安徽医科大学第三附属医院，合肥 2300612安徽农业大学植物保护学院，合肥 2300363皖南医学院口腔医学院，芜湖 241002

项先旺，男，硕士研究生；陈传俊，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：ccj6318@sina.com