沉默Ska2基因对人胶质瘤细胞增殖的影响

贺小军，马春春，卞尔保，王洪亮，宗 钢，赵 兵



沉默Ska2基因对人胶质瘤细胞增殖的影响

贺小军，马春春，卞尔保，王洪亮，宗 钢，赵 兵

目的 采用siRNA沉默Ska2基因，探讨其对人胶质瘤细胞生长的影响及其潜在的分子机制。方法 对照组人胶质瘤细胞予以siRNA阴性序列转染，实验组予以siRNASka2序列转染。每组细胞转染48 h后应用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析Ska2 mRNA表达情况。Western blot法分析Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表达情况，MTT法及细胞克隆实验分析Ska2对A172细胞增殖及克隆形成能力的影响。结果 qRT-PCR结果显示实验组Ska2 mRNA表达较对照组显著减少（P＜0.01），Western blot结果显示实验组Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表达水平亦较对照组显著降低（P＜0.01），MTT实验显示实验组中活细胞数明显低于对照组（P＜0.05）；细胞克隆法显示实验组细胞的增殖克隆形成能力明显低于对照组（P＜0.01）。结论 沉默Ska2基因、减少人胶质瘤细胞Ska2基因的表达能够抑制胶质瘤细胞的增殖。

Ska2；胶质瘤；细胞增殖

网络出版时间：2016-6-6 13：52：31 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.006.html

纺锤体与动粒相关复合物（spindle and kineto-chore associated complex，Ska）包括Ska1、Ska2和Ska3［1］。Hanisch et al［2］发现了Ska1，并通过酵母双杂交技术进一步筛选得到一个新的能够与Ska1结合的蛋白即FAM33A，将其重新命名为Ska2。近年，Ska家族的第3个成员Ska3也几乎同时被发现并报道［3］。Ska2是一个最近鉴定的参与细胞周期调控与肿瘤发生发展的新基因［2，4］。Ska2在细胞周期中的作用，目前认为该基因可通过与Ska1、Ska3形成Ska复合体，维持有丝分裂中期赤道板和关闭纺锤体检测点，保证细胞能够“适时”完成有丝分裂中期并进入有丝分裂后期［2，5］。Hanisch et al［2］采用RNA干扰技术抑制Ska2表达后，大量细胞被停滞或延迟在有丝分裂中期，虽然细胞仍能最终完成有丝分裂，但细胞从有丝分裂前期进入后期所需的时间明显延长。Shi et al［6］发现Ska2在小细胞肺癌和乳腺癌中呈现表达上调。此外，Ska2还可通过糖皮质激素受体等途径参与细胞增殖调节和肿瘤发生发展［7-10］。然而，Ska2基因在人胶质瘤的作用尚未见文献报道，该研究旨在探讨siRNA沉默Ska2后对人胶质瘤A172细胞增殖的影响，为进一步深入研究Ska2在胶质瘤中的作用机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1主要材料及试剂 人胶质瘤细胞株A172购自上海生命科学研究院细胞库；培养基DMEM、胎牛血清、胰酶消化液均购自美国Hyclone公司；脂质体Lipofectamine 2000、TRIzol均购自美国Invitrogen公司；Ska2抗体购自英国Abcam公司；PCNA、Cyclin D1抗体购自北京博奥生物公司；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）购自日本TaKaRa公司；7900型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；20 μl的反应体系包括10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix购自美国ABI公司；5′和3′端引物（3 μmol/L）各1 μl和1 μl的cDNA模板、7 μl dd H2O购自上海生物科技有限公司；兔抗人Ska2、羊抗人β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG、兔抗羊IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL购自美国Thermo Fisher公司；FlexCycler多功能PCR仪购自德国Jena公司；MTT试剂购自美国Sigma公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、DMSO试剂、Western一抗稀释液及RIPA裂解液（强）均购自上海碧云天公司；NanoPhotometer Pearl 330购自德国IMPLEN公司；siRNA寡核苷酸片段由上海吉玛公司合成；Ska2引物由上海生物工程公司合成。siRNA-Ska2序列和siRNA阴性对照序列见表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1细胞转染 购买50代以内人胶质瘤细胞株A172，将其培养于含10%新生胎牛血清DMEM培养液中，恒温恒湿培养箱设定参数为37℃、5%CO2浓度。取对数生长期A172细胞，用0.25%胰酶消化液消化，800 r/min离心5 min，取适量培养基制成细胞悬液并计数，按40×104个/瓶接种于培养瓶中；接种24 h后，待培养瓶中细胞汇合达约70%时即可进行脂质体Lipofectamine 2000介导的转染。第一组予以siRNA阴性对照序列（对照组）、第二组予以siRNA-Ska2序列（实验组）进行转染，以此建立细胞模型。

1.2.2qRT-PCR检测A172细胞中Ska2 mRNA表达变化 细胞转染后，提取实验组及对照组细胞总RNA，分别将其逆转录成cDNA。用7900型荧光定量PCR仪进行反应扩增，Ska2上游引物：5′-CCGCTTTAAACCAGTTGCTG-3′，下游引物：5′-CTCTGCCGCAGTTTTCTCTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′，下游引物：5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTT-3′。反应条件如下：95℃预热10 min；95℃变性15 s；60℃退火1 min，共45个循环。并于反应结束后记录实验组和对照组结果。以GAPDH作为内参，相对表达量=2-ΔΔCt值，以对照组mRNA表达量的均数为1，计算出实验组mRNA的相对表达量。

1.2.3Western blot法检测A172细胞中Ska2、PCNA和Cyclin D1蛋白表达情况 细胞转染后，提取实验组及对照组细胞总蛋白，用BCA试剂检测各组蛋白浓度并定量。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳（浓缩胶浓度5%，分离胶浓度8%），电转30 min后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h；加入一抗为兔抗人Ska2抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜，洗膜；加入二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG（1∶10 000），室温轻摇1 h，洗膜；加入ECL反应液，暗室显影、定影后扫描。以β-actin作为参照。

1.2.4MTT法检测A172细胞生长 细胞培养和处理同前，将对照组正常A172细胞及实验组转染后A172细胞按1×104/孔接种于96孔板，每组设复孔5个，作常规培养。分别取培养后0、12、24、48、72 h 5个时间点的培养板，弃去培养基，每孔依次加入MTT（5 mg/ml）10 μl，继续孵育4 h后吸尽每孔中的培养液；加入DMSO 150 μl/孔，于水平摇床上振荡6 min，测定492 nm的吸光度（absorbance，A）值。以时间为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制细胞生长曲线图。存活率（%）=实验组细胞A值/对照组细胞A值×100%。

1.2.4细胞克隆实验检测细胞增殖 细胞培养和处理同前，将转染后的A172细胞按200个/孔接种于6孔板，设为实验组；取相同数目的正常A172细胞接种于6孔板，设为对照组；每组各设3个复孔进行常规培养。每孔加入培养基2 ml，每3 d换液并观察细胞增殖情况，10 d后弃培养基，每孔加入4%多聚甲醛1 ml固定30 min后，再加入美兰染料0.8 ml染色，20 min后弃去染料，轻轻漂洗数次后晾干，在显微镜下观察并进行拍照。

1.3统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验数据以±s表示，组间比较采用t检验或方差分析。

2　结果

2.1A172细胞Ska2基因表达 qRT-PCR结果显示，实验组Ska2 mRNA水平的表达量明显低于对照组，差异有统计学意义（t=7.28，P＜0.01），见图1。

图1　实验组与对照组Ska2 mRNA的表达情况

2.2A172细胞Ska2蛋白表达变化 Western blot结果显示，两组内参β-actin蛋白的表达相近，而与对照组比较，实验组Ska2蛋白表达明显减少（t= 9.12，P＜0.01），见图2。

图2　Ska2蛋白的表达情况

2.3Ska2基因对A172细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，与对照组比较，实验组在转染0、12、24 h时A172细胞生长差异无统计学意义，但转染48 h 及72 h后，实验组A172细胞较对照组生长明显受抑制（t=8.27，P＜0.05），见图3。

图3　不同时间点A172细胞增殖生长情况

2.4Ska2基因对A172细胞增殖克隆形成能力的影响 10 d后将做细胞克隆实验的6孔板放置在显微镜下，观察实验组与对照组细胞克隆增殖的情况。与对照组比较，实验组细胞增殖明显受到抑制（t= 10.45，P＜0.01），见图4。

图4　细胞克隆增殖形成情况 ×100

2.5A172细胞中PCNA和Cyclin D1蛋白表达变化 Western blot结果显示，两组内参β-actin蛋白的表达相近，而与对照组比较，实验组PCNA和Cyclin D1蛋白的表达明显减少（t=12.13，P＜0.01），见图5。

图5　PCNA与Cyclin D1蛋白的表达情况

3　讨论

胶质细胞瘤是人脑组织中最常见的原发恶性肿瘤，有高度侵袭性、神经破坏性，被认为是人类最致命的癌症之一［11］。人类对恶性胶质细胞瘤的发病机制尚不清楚，其治疗策略相对有限，目前最主要的治疗手段是手术联合放化疗，但治疗效果仍然不甚理想。因此，研究胶质瘤基因改变的分子机制有助于从根源上发现与肿瘤相关的基因位点，通过阻断和促进某位点基因的表达情况来说明此位点对胶质瘤致瘤性的影响。无限、不受控制地增殖是肿瘤细胞的特性，通过阻断肿瘤细胞无限增殖的致癌基因无疑是研究的热点。

Ska2是细胞分裂过程中必不可少的调控因子。文献［6，12-13］证实Ska2参与肺癌、乳腺癌等多种肿瘤发生发展过程。本实验采用siRNA沉默Ska2，探究其对人胶质细胞瘤A172增殖的影响，将胶质细胞瘤Ska2基因沉默作为实验组，同时建立仅予以siRNA阴性对照序列的对照组与之相比较。对两组细胞进行实验后，首先qRT-PCR和Western blot结果均证实Ska2-siRNA可明显抑制胶质瘤细胞中Ska2 mRNA转录和蛋白表达。随后，验证Ska2是否影响胶质瘤细胞的增殖。MTT实验结果提示实验组在转染Ska2-siRNA后，细胞增殖生长显著受到抑制；克隆实验结果证实了实验组细胞增殖克隆形成能力显著受到抑制。实验结果均支持沉默Ska2后，可以抑制胶质瘤细胞的增殖活性。由此可见Ska2基因是一种重要潜在的原癌基因，在促进肿瘤增殖生长中有重要作用。

文献［12］报道Ska2可通过参与糖皮质激素受体相关信号通路来调节细胞增殖。糖皮质激素因能抑制肿瘤细胞生长而被广泛用作肿瘤化疗药物。某些小细胞肺癌细胞也因本身糖皮质激素受体缺陷而表现出对糖皮质激素的耐药性［14］。Ska2通过与糖皮质激素受体的直接相互作用而调节糖皮质激素受体的功能及糖皮质激素的细胞增殖抑制作用。过表达Ska2可导致Dex激活的糖皮质激素受体转录激活活性得到进一步增强；而采用RNAi技术抑制Ska2的表达后，Dex激活的糖皮质激素受体转录激活活性和细胞增殖抑制能力均显著削弱或丧失［12］。此外，敲减糖皮质激素受体β可特异性的抑制胶质瘤细胞增殖的能力［15］。

为进一步深入研究Ska2是如何调控胶质瘤细胞增殖分子机制，本研究检测了增殖相关蛋白Cyclin D1与PCNA在实验组和对照组中的表达情况。Western blot结果提示敲减Ska2基因后，实验组增殖相关蛋白PCNA与Cyclin D1的表达含量与对照组比较明显抑制。以上实验结果说明沉默Ska2基因从而抑制胶质瘤细胞的增殖可能与减少了增殖相关蛋白Cyclin D1与PCNA的表达有关。

结合本次研究结果及Ska2对肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的表达情况综合考虑，Ska2基因与胶质瘤发生、发展密切相关。siRNA特异性沉默Ska2基因后，明显抑制了胶质瘤细胞A172的增殖活性，因此Ska2基因可能是治疗胶质瘤及其他肿瘤潜在的理想靶点。然而对于Ska2基因在胶质瘤细胞中的确切作用机制、作用途径及Ska2基因与其他和胶质瘤相关的基因相互作用的关系尚有待于进一步阐明。

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Effects of Ska2 silencing on the cell proliferation of human glioma cells

He Xiaojun，Ma Chunchun，Bian Erbao，et al
（Dept of Neurosurgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To analyze the effects of Ska2 after siRNA silencing on human glioma cells growth and its potential molecular mechanisms.Methods The cultured human glioblastoma cell line A172 was divided into two different groups：the control group and the experimental group.The control group was treated with siRNA negative sequence transfection；the experimental group with siRNA-Ska2 sequence transfection.48 hours later，the expressions of Ska2 mRNA was analyzed by qRT-PCR.The protein expressions of Ska2，PCNA，and CyclinD1 were analyzed by Western blot.The proliferation ability and the colony-formation ability of cell were investigated through MTT Assay and cell cloning Assay.Results qRT-PCR analysis showed that mRNA expression in Ska2 of the experimental group was significantly reduced compared with the control group（P＜0.01）；Western blot indicated a great decline of Ska2 in PCNA and CyclinD1 protein expression in the experimental group（P＜0.01）；MTT Assay revealed that the number of viable cell was lower than that of the control group（P＜0.05）；cloning experiment indicated that colony-formation ability was weaker than that of the control group（P＜0.01）.Conclusion Silencing of Ska2 and reducing the gene expression of Ska2 in human glioma cells inhibit cell proliferation.

Ska2；glioma；cell proliferation

R 739.41

A

1000-1492（2016）07-0930-05

2016-03-23接收

国家自然科学基金青年基金（编号：81402078、81502149）；安徽省自然科学基金项目（编号：1508085MH194）

安徽医科大学第二附属医院神经外科，合肥 230601

贺小军，男，硕士研究生；赵 兵，男，副教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：zhaopumcmd@yeah.net