长链非编码RNA SPRY4-IT1对膀胱癌生长的影响

陈　明伟，黎　健发，庄　成乐，刘　宇辰，陈　志聪，何　安　邦，张　巧　霞，黄卫　人，蔡　志　明



长链非编码RNA SPRY4-IT1对膀胱癌生长的影响

陈明伟1，2，3，黎健发2，3，庄成乐2，3，刘宇辰2，3，陈志聪2，3，何安邦1，3，张巧霞2，黄卫人1，2，3，蔡志明1，2，3

目的 研究长链非编码RNA（LncRNA）SPRY4内含子转录本1（SPRY4-IT1）对膀胱癌生长的影响。方法 使用qRT-PCR法检测SPRY4-IT1标本和细胞表达水平并分析其临床病理特征之间的关联；使用特异性小干扰RNA（si-SPRY4-IT1）转染两种膀胱癌细胞，使用qRT-PCR法检测si-SPRY4-IT1效果，再分别以CCK-8实验、MTT实验、划痕实验、ELISA实验和流式细胞术检测SPRY4-IT1对膀胱癌细胞在增殖、迁移和凋亡等方面的影响。结果 SPRY4-IT1在膀胱癌组织中高表达（68.33%，P=0.026 3）。SPRY4-IT1表达水平与病理分级（P＜0.05）和TMN分期（P＜0.001）有关。SPRY4-IT1在5637（P=0.002 29）和T24（P=0.000 12）细胞中明显高表达。si-SPRY4-IT1可显著降低SPRY4-IT1表达（P＜0.001）；si-SPRY4-IT1可显著抑制两种细胞的增殖、迁移和增加凋亡（P＜0.01）。结论 SPRY4-IT1在膀胱癌标本组织和细胞水平中高表达，有促进膀胱癌细胞生长的作用，在膀胱癌中起着癌基因的作用。

膀胱癌；长链非编码RNA；SPRY4-IT1；细胞增殖；细胞迁移；细胞凋亡

网络出版时间：2016-6-6 13：52：32 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.026.html

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，其发病率在人类肿瘤发病率中位居前列，并呈明显的上升趋势，严重危及人类健康［1］。尽管目前膀胱癌的诊疗已经取得了长足进步，但仍有许多问题亟待解决。早中期膀胱癌主要以手术治疗，晚期膀胱癌患者手术效果较差，并且对放、化疗多不敏感，复发率、死亡率高［2-4］。所以进一步研究膀胱癌机制对膀胱癌诊疗有重要临床意义，尤其对放化疗不敏感的晚期患者有重要意义。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一类转录本长度大于200个核苷酸的不翻译和编码蛋白的长链RNA，目前人类基因组中LncRNA大约有23 000个，LncRNA进行大量的研究［5-7］，发现其在肿瘤的发生发展起着重要的作用，但进一步的在疾病中发生的机制却缺少突破性研究成果。SPRY4-IT1（SPRY4 intronic transcript 1）（基因ID：100642175）是一种目前研究较成熟的LncRNA，其异常表达与乳腺癌、胃癌、肺癌、肾癌和脑肿瘤等多种肿瘤疾病相关联，提示其可能是一类必要的癌症发生相关联的疾病因子［8-15］。文献［14］报道SPRY4-IT1与膀胱癌的预后等相关，该研究进一步观察非编码RNA SPRY4-IT1对膀胱恶性细胞生过程长的影响及与临床病理特征联系，为膀胱癌的诊疗提供新的精准医疗靶标，开辟新的途径。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1膀胱癌患者标本及对应的资料 随机选用60例深圳市第二人民医院生物资源标本库保存的膀胱癌及其配对的癌旁正常组织标本（2013年6月～2015年6月收集于安徽医科大学第一附属医院泌尿外科、南方医科大学珠江医院泌尿外科、中山大学肿瘤医院泌尿外科以及深圳市第二人民医院泌尿外科等医院行全膀胱手术切除的膀胱癌患者标本，所取标本均取得患者或家属知情同意书签字，并且得到各就诊医院和深圳市第二人民医院医学伦理委员会的正式批准）。患者纳入标准：病理诊断为膀胱恶性肿瘤并接受全膀胱切除手术，并取得患者或家属知情同意书签字。排除标准：手术前接受化疗等其他治疗；病理诊断为膀胱良性肿瘤，病理诊断为其它的癌症；拒绝签署同意书。每对标本包括手术切除后经病理证实的膀胱癌组织及其配对癌旁正常组织（距离癌组织 ＞5 cm）各1份。膀胱肿瘤大小测量采用1999年WHO的RECIST标准即单径测量法，以肿瘤的最大径（cm）的变化代替体积的变化。本研究组织学类型分类采用WHO膀胱癌病理分级分类标准（2004年），临床分期采用国际抗癌组织（UICC）及美国癌症联合会（AJCC）临床分期的标准（2009年）。

1.1.2膀胱癌细胞系及正常细胞5637和T24两种膀胱癌细胞系以及正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1均购自中科院上海生科院。

1.1.3主要试剂 Lipofectamine 2000转染试剂、TRIzol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司）；1640、DMEM和F12培养基、谷氨酰氨、进口胎牛血清（FBS）（混合1%青霉素-链霉素）（美国Gibco公司）；细胞毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK8）、MTT、DMSO（美国Sigma aldrich公司）；人胱天蛋白酶3（human Caspase 3）和ELISA检测试剂盒（中国武汉华美生物公司）；特异性si-SPRY4-IT1（5-CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCT-3′）［12］、对照组si-NC（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′）（苏州吉玛基因股份有限公司）。

1.1.4主要仪器 高速冷冻离心机、微量核酸蛋白检测仪（美国Thermo公司）；Thermal Cycler C1000 PCR仪（美国BIO-RAD公司）；实时荧光Light Cycler 480Ⅱ定量 PCR仪（瑞士Roche公司）；迷你离心机（江苏其林贝尔公司）；酶标检测仪（芬兰Thermo公司）；恒温水箱（上海比朗公司）；流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.2培养细胞膀胱癌（人）细胞5637、T24分别培养于1640和DMEM培养基（含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素混合液），放置于37℃、5%CO2的培养箱培养，规范换液传代。

1.3转染 在6、12、24、96孔细胞培养板取适量细胞铺板培养，贴壁细胞融合度需达到40%～60%时（部分实验融合度需要达到90%～100%），遵循生产厂家说明书通过Lipofectamine 2000将siRNA（si-SPRY4-IT1和si-NC）转染入细胞，并放置于37℃培养箱继续孵育4～6 h后，分别重新换1640和DMEM培养基（含10%胎牛血清）继续培养。

1.4实时荧光定量qRT-PCR 严格依照TRIzol试剂说明书提取标本及细胞RNA，cDNA逆转录严格遵循PrimeScript RT Reagent Kit说明书的规范标准。依据标准的逆转录和实时荧光定量 qRT-PCR试剂说明书设置相应的反应条件和参数，内参为GAPDH，进行cDNA逆转录合成和相应的qT-PCR扩增。上下游引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，SPRY4-IT1 F：5′-TAAGCTTGTA GAGATGGGGGTTTCATCCTGTTGG-3′，R：5′-ACTCG AGAAAGACTCCCTTTCCTTAAGCAGATTCAC-3′［12］；GAPDH F：5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，R：5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。采用2-ΔΔCt法数据分析，其计算公式为：ΔCt=CtSPRY4-IT1-CtGAPDH，ΔΔCt=实 验 组（CtSPRY4-IT1-CtGAPDH）-阴性 对照组（CtSPRY4-IT1-CtGAPDH）。

1.5CCK-8实验 取适量的细胞于96孔板接种培养，隔天分别转染si-SPRY4-IT1和si-NC，实验组和对照组两组各设置6个复孔，转染后0、24、48和72 h各时间点进行CCK-8检测。每次加入CCK-8溶液相当于各孔总体积的1/10，即每孔10 μl，1 h以后以450 nm波长检测细胞光密度（optical density，OD）值，观察两组差异。

1.6MTT实验 取适量的对数生长期细胞于96孔板接种培养，隔天分别转染si-SPRY4-IT1和si-NC，实验组和对照组各设置6个复孔，转染后0、24、48和72 h各时间点进行MTT检测。实验终止前4 h每孔加入10 μl MTT溶液，4 h后，每孔加入150 μl的DMSO，10 min震荡，以波长490 nm在酶标仪检测各孔细胞OD值，观测两不同处理组差异。

1.7细胞迁移试验 取适量的细胞接种于6孔板中培养，按照上述实验分组转染4～6 h后，每组实验设3个复孔，细胞的融合度需达到90%以上，用200 μl无菌移液枪头划线立即在光学显微镜下拍照，放置于37℃5%CO2细胞培养箱中继续培养，24 h后再次在显微镜下拍照，取5个视野，测量划痕两侧细胞间距取平均值，实验重复3次。

1.8ELISA实验 在24孔板中接种适量的细胞培养，24 h后转染si-RNA，实验组和阴性对照组分别各设6个复孔，48 h后收集细胞，用PBS重悬后反复冻融裂解细胞。在已经包被Caspase-3抗体的聚苯乙烯板的反应孔中加入细胞裂解液，37℃中孵育30 min，弃液后3次洗板；再加入辣根过氧化物酶标记工作液，37℃孵育30 min；弃液再5次洗板后加入底物溶液，20 min避光显色，最后加入终止液。反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长下测量每孔OD值，OD值大小可以间接反映Caspase-3的酶活性，进而说明细胞凋亡程度。

1.9流式细胞仪检测实验 细胞转染后48 h，消化收集细胞并洗涤，然后重悬于200 μl的结合缓冲液，加入10 μl Annexin V-FTC和5 μl的PI后轻轻地混匀，避光室温反应15 min，再加入300 μl结合缓冲液，使用流式细胞仪测定细胞凋亡，细胞凋亡率以百分数表示。

1.10统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析，上述所有实验均重复3次，实验数据以±s表示，组间差异采用t检验比较，多组间采用单因素方差分析比较（CCK-8和MTT实验数据）。图表用GraphPad Prism 6.0生成。

2　结果

2.1SPRY4-IT1在膀胱癌标本和膀胱癌细胞系中高表达以及其表达量与临床病理特征之间的联系

膀胱癌组织中SPRY4-IT1表达明显高于癌旁正常组织，其中高表达41例（68.33%）（t=6.835，P= 0.026 3），见图1A。进一步研究结果提示：膀胱癌SPRY4-IT1表达水平与患者TMN分期（P＜0.001）和病理分级（P=0.024）有关，而与性别、年龄、肿瘤大小和淋巴结转移等无明显相关，见表1。相对于正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1），膀胱癌细胞在5637（t=6.919，P=0.002 29）和 T24（t=14.622，P =0.000 12）中明显高表达（图1B）。

表1　SPRY4-IT1表达水平与膀胱癌临床病理特征之间的关系［n（%）］

2.2si-SPRY4-IT1可显著下调膀胱癌细胞SPRY4-IT1表达 与si-NC组比较，在si-SPRY4-IT1组细胞 SPRY4-IT1表达均显著降低，在5637（t =5.391，P=0.0057）和T24（t=17.868，P＜0.001）细胞系中差异均有统计学意义，见图2。表明si-SPRY4-IT1可明显下调5637及T24细胞内SPRY4-IT1的表达。

图1　SPRY4-IT1在膀胱癌组织和细胞系中的表达

图2　si-SPRY4-IT1对　SPRY4-IT1相对表达量的影响

2.3si-SPRY4-IT1抑制5637和T24细胞增殖CCK-8实验结果显示，si-SPRY4-IT1转染细胞后24、48、72 h较对应时间si-NC组OD值明显降低，在5637（F=33.948，P＜0.001）和 T24（F=71.910，P ＜0.001）细胞系差异均有统计学意义。见图3。MTT实验结果显示，与si-NC组比较，si-SPRY4-IT1转染细胞后对应的各时间段OD值明显降低，在5637（F=45.730，P＜0.001）和 T24（F=21.894，P ＜0.001）差异有统计学意义，见图4。

图3　CCK-8检测si-SPRY4-IT1对膀胱癌细胞增殖的影响

图4　MTT检测si-SPRY4-IT1对膀胱癌细胞增殖的影响

2.4si-SPRY4-IT1可抑制5637和T24的细胞迁移 与si-NC组比较，si-SPRY4-IT1组膀胱癌细胞系迁移明显被抑制，在5637（t=5.749，P=0.004 54）和T24（t=5.664，P=0.004 79）细胞系中差异均有统计学意义，见图5。

图5　si-SPRY4-IT1对膀胱癌细胞迁移的影响

2.5si-SPRY4-IT1可增加5637和T24的细胞凋亡 与si-NC组比较，ELISA实验显示si-SPRY4-IT1组的Caspase-3相对活性分别显著增加，在5637（t =8.947，P=0.000 86）和 T24（t=7.372，P=0.001 80）细胞系中差异均有统计学意义。流式细胞术实验显示si-SPRY4-IT1组的凋亡细胞数目明显增加。见图6。

3　讨论

目前恶性膀胱癌是主要危及人类健康的肿瘤疾病之一，其主要的治疗方法早期主要是手术治疗，包括部分电切同时加以辅助化疗，但易复发；对于高级别浸润性以及多发肿瘤等则主张早期全切，但其术后生活质量却明显下降；对于晚期癌症，生存率低，主要放化疗治疗，但易发生耐药等［1-4］。因此，探索新的膀胱癌诊断技术、分子标志物以及新的治疗方法极有重要的意义。

图6　si-SPRY4-IT1对膀胱细胞的凋亡的影响

非编码RNA的研究起步较晚，很长时间里一直被认为是无功能因而被人们忽视转录“噪音”。在过去十年中，研究［6-9］显示许多LncRNA在各种疾病尤其是肿瘤中异常表达，预示着其在肿瘤的发生发挥重要的调控作用，而进一步的深入研究也证实这种调控作用；相对于在肿瘤中研究较成熟的microRNA，LncRNA的研究起步较晚，对于这种在癌症中异常表达的不编码蛋白长链RNA的功能和机制有待进一步研究探索，异常表达的LncRNA将有助于对肿瘤的诊断治疗以及预后指导。因而，研究膀胱癌中异常表达的LncRNA及其功能机制对于提高膀胱癌的诊疗水平有重要的指导意义。

人的SPRY4-IT1碱基序列全长703 bp，基因位于染色体5q31.3。虽为抑癌基因SPRY4的内含子区转录产物，但SPRY4-IT1表现出癌基因的特征。如上所述，SPRY4-IT1在众多肿瘤起着有重要的调控作用。非编码RNA SPRY4-IT1可预测胃癌的预后和促进肿瘤的发生［9］，其通过上调 ZNF703表达量促进乳腺癌细胞增殖［10］，与肾透明细胞癌和食管癌密切预后相关，可以调节黑色素瘤的凋亡和侵袭［11-13］；同时可以调节滋养层细胞增殖、迁移和凋亡等。由此假设SPRY4-IT1可能对膀胱癌细胞生长有重要影响。

本研究显示，相对于癌旁组织和正常上皮细胞，膀胱癌组织和细胞水平中SPRY4-IT1明显高表达。进一步研究结果表明si-SPRY4-IT1可下调SPRY4-IT1表达并且显著抑制细胞增殖、迁移和促进凋亡，SPRY4-IT1是一种起着癌基因作用，并且正调控膀胱癌细胞生长因子，与文献［8-15］报道一致。因此，深入研究SPRY4-IT1促进膀胱癌细胞生长机制对理解膀胱癌发生、发展以及转移有非常重要的意义。同时通过研究临床病理资料分析显示SPRY4-IT1的表达与病理分级、临床分期等相关，而与年龄、性别以及肿瘤大小等无明显关联，进一步说明SPRY4-IT1有重要的临床意义，将其真正转化为临床应用是下一步研究的重点。

随着不断进步的分子生物学技术的发展，尤其是分子筛选技术的进步为LncRNA机制研究提供新的方法和途径。研究［13］表明细胞质的SPRY4-IT1的二级结构含有可能起着特殊作用的数个茎环和假结。在乳腺癌中SPRY4-IT1通过上调ZNF703 mRNA表达促进人乳腺癌细胞增殖［10］，在非小细胞肺癌中SPRY4-IT1通过组蛋白甲基化转移酶（EZH2）促进生长和转移等，同时肺癌的侵袭性和转移性能力是通过SPRY4-IT部分调节上皮细胞间质转型（epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT）的作用［15］；在胃癌细胞中SPRY4-IT1可能通过DNA的甲基化而发挥作用，胃癌的转移被发现可能是SPRY4-IT1调节EMT实现的［9］，暗示在膀胱癌存在着类似的调控机制，为进一步研究膀胱癌作用机制提供了思路，推断SPRY4-IT1可能在膀胱癌中通过调节某种mRNA（ZNF703）或 DNA甲基化进而影响蛋白（EZH2）变化发挥其相应的生物学功能，SPRY4-IT1影响膀胱癌侵袭能力等可能和其他肿瘤类似的调节过程即部分调节EMT等，但尚需进一步验证。

综上所述，本实验确定了LncRNA SPRY4-IT1对膀胱癌细胞增殖、迁移以及凋亡等生长过程的正调控作用，在膀胱癌疾病中起着肿瘤癌基因的作用，为深入研究其在膀胱癌的作用机制奠定基础。同时可作为膀胱癌治疗的精准医疗生物分子靶标，从而改变目前晚期膀胱癌治疗瓶颈。

（致谢：此文章获得深圳市医疗卫生“三名工程”资助）

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Long non-coding RNA SPRY4-IT1 inhibited the progression of bladder cancer

Chen Mingwei1，2，3，Li Jianfa2，3，Zhuang Chengle2，3，et al
（1Dept of Urology，Shenzhen Second People′s Hospital，Clinical Institute of Anhui Medical University，Shenzhen 518035；2Key Laboratory，3Dept of Urology，Shenzhen Second People′s Hospital，Shenzhen 518035）

Objective To investigate the effect of long non-coding RNA（LncRNA）SPRY4 intronic transcript 1 （SPRY4-IT1）on the cell progression of bladder cancer.Methods To detect the SPRY4-IT1 expression by qRTPCR and to analyze the correlation between its expression and clinical pathological features in the specimens and cells of bladder cancer.The specific small interfere RNA（si-SPRY4-IT1）was transfected into two bladder cancer cell lines respectively，and the transfection efficiency was evaluated by qRT-PCR.Then the CCK-8 assay，MTT assay，migration assay，ELISA and flow cytometry assay were used to detect cell proliferation，migration and apoptosis.Results The SPRY4-IT1 expression was obviously up-regulated in 68.33%of cancer samples（P=0.026 3）and related to bladder cancer histological grade（P＜0.05）and TNM stage（P＜0.001）.The SPRY4-IT1 expression was obviously increased in 5637（P=0.002 29）and T24（P=0.000 12）.The expression of SPRY4-IT1 could be down-regulated by si-SPRY4-IT1（P＜0.001）.Si-SPRY4-IT1 could remarkably inhibit the proliferation（P＜0.001），suppress imigration（P＜0.01）and increase apoptosis（P＜0.01）.Conclusion SPRY4-IT1 is up-regulated in bladder cancer tissues and cells.SPRY4-IT1 plays an oncogene role in promoting cell growth of bladder cancer.

bladder cancer；long non-coding RNA；SPRY4-IT1；cell proliferation；cell imigration；cell apoptosis

R 737.14

A

1000-1492（2016）07-0978-07

2016-03-23接收

国家重点基础研究发展计划（973计划）（编号：2014CB745200）；国家自然科学青年基金（编号：81402103）；国家高技术研究发展计划（863计划）（编号：2014AA020607）；广东省自然科学基金（编号：2014A030313717）；深圳 市 科 技计划 项 目（编 号：JCYJ20150330102720130、GJHZ20150316154912494）

1安徽医科大学深圳市第二人民医院临床学院泌尿外科，深圳 518035深圳市第二人民医院2中心实验室、3泌尿外科，深圳518035

陈明伟，男，硕士研究生；黄卫人，男，研究员，责任作者，E-mail：pony8980@163. com；蔡志明，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：caizhiming2000@163.com