重楼总苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖、迁移的影响

苏菲菲，卢木娣，曾惠红，江文良，赖文娟，梁堂钰，赖雪燕，龙剑文



重楼总苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖、迁移的影响

苏菲菲1，卢木娣1，曾惠红1，江文良1，赖文娟1，梁堂钰1，赖雪燕1，龙剑文2

目的 探讨重楼总苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系（ARPE-19）增生、迁移的影响。方法 MMT法检测重楼总苷Ⅰ对ARPE-19细胞增殖的影响，Transwell小室实验检测ARPE-19细胞侵袭能力的变化，划痕实验检测ARPE-19细胞迁移能力的变化，实时荧光定量PCR检测ERK1/2 mRNA的表达，Western blot法检测ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表达水平。结果 重楼总苷Ⅰ可抑制ARPE-19细胞的增生、侵袭、迁移，下调p-ERK1/2蛋白的表达，差异有统计学意义（P＜0.01），但对总ERK1/2表达、ERKl mRNA和ERK2 mRNA表达无明显影响。结论 重楼总苷Ⅰ能有效抑制ARPE-19细胞的增殖、侵袭、迁移，可能与重楼总苷Ⅰ抑制了ARPE-19细胞ERK1/2蛋白磷酸化有关，为中药重楼治疗增生性玻璃体视网膜疾病提供了依据。

重楼总苷Ⅰ；增殖；迁移；视网膜色素上皮细胞

网络出版时间：2016-6-6 13：52：32 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.016.html

人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞增生、迁移，细胞外基质成分（extracellular matrix，ECM）异常沉积，形成有收缩能力的增生膜，是增生性玻璃体视网膜疾病（PVR）发生和发展的重要环节［1］。研究［2］表明，RPE细胞在PVR的发展中起着最重要的作用。重楼是中医治疗PVR的常用药物之一［3］，研究［4-6］表明，其有效成分重楼总苷Ⅰ对一些肿瘤细胞有抑制作用，但对人RPE细胞作用如何，目前暂无报道。该研究观察了重楼总苷Ⅰ对人RPE细胞增生、迁移的影响，以及对其ERK1/2 mRNA表达、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表达的影响，探讨重楼总苷Ⅰ治疗PVR的可能机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器 重楼皂苷Ⅰ粉剂购自中国药品生物制品检定所；人视网膜色素上皮细胞系（ARPE-19）细胞株购自武汉大学细胞库中国典型培养物保藏中心；100 U/L青霉素、100 μg/L链霉素、MTT试剂盒购自武汉博士德生物公司；DMEM培养基、小牛血清和胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；分光光度仪购自芬兰Labsystems公司；细胞培养箱（热电3111型）购自美国热电公司；TRIzol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司；Quantonestep RTPCR Kit购自北京天根生化公司；ERK1/2、p-ERK1/ 2、辣根酶标记抗鼠lgG抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根酶标记的β-actin抗体购自上海兴悠生物科技有限公司；ECL试剂盒购自美国Amersham Biosciences公司；Transwell小室购自美国Millipore公司。

1.2MTT法检测不同浓度药物对ARPE-19细胞增生的影响 将ARPE-19细胞以5×104/孔接种于96孔板，每孔接种100 μl，培养液为含有10%小牛血清的DMEM，待细胞长至 60%～70%融合状态时，加入处理因素，每组重楼皂苷Ⅰ终浓度分别为0、0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml，每组均设6个平行孔，培养24 h后加入20 μl MTT（5 mg/ml），继续培养4 h后加入 DMSO振荡，调零，酶标仪570 nm波长处检测光密度（optical density，OD）值，细胞生长抑制率（IR）=1-OD实验组/OD空白对照组，实验重复3次。

1.3Transwell实验检测重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞侵袭能力的影响 在上室膜表面均匀铺培养基稀释的Matrigel（1∶3），37℃培养箱中放置30 min，Matrigel凝固。再加入200 μl无血清悬浮培养基，轻洗水化基底膜后备用。取对数生长期的ARPE-19细胞常规消化后，加入终浓度为0、1.5、3.0、6.0 μg/ ml重楼皂苷Ⅰ，孵育1 h后，调整浓度为5×105个/ ml，取200 μl细胞悬液加入上室，另取200 μl含20%FBS的培养基放置于 Transwell下室内，每组均设6个复孔，培养48 h后，取出小室，先弃去培养基，棉签擦去位于上室的细胞，PBS漂洗2次，每孔加入10%甲醇溶液固定，再弃甲醇溶液，加入结晶紫染色，弃染色液，蒸馏水洗涤、干燥，显微镜下随机选取5个视野，计数侵袭细胞数，实验独立重复3次。

1.4划痕实验检测低氧对ARPE-19细胞迁移能力的影响 细胞培养，分组同1.3，取单层融合的ARPE-19细胞，用20 μl枪头在细胞层上垂直划线，PBS冲洗3次，去除划下的细胞，培养48 h，显微镜下观察细胞的迁移情况，软件分析并计算平均划痕愈合率。

1.5测定ERK1/2 mRNA表达水平 ARPE-19细胞培养，分组同1.3。设计上、下游引物，ERK1上游引物：5-GAACTCCAAGGGCTATACCAAGT-3，下游引物：5-GGAGGGCAGAGACTGTAGGTAGT-3，产物164 bp；ERK2上游引物：5′-TCCCCATCACAAGAAGACCT-3′，下游引物：5′-AGTCAGCATTTGGGAACAGC-3′，产物 106 bp；GAPDH上游引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-TGGAGGGATCTCGCTCCTGGAAGAT-3′，GAPDH扩增长度为214 bp。提取ARPE-19细胞总RNA；cDNA合成；取cDNA 1 μl，2.5×RealMasterMix/20×SYBR溶液11.25 μl，上下游引物各1 μl，加无Rnase水，总反应体积25 μl；PCR反应条件为：95℃变性2 min，循环95℃变性15 s，50℃退火30 s，68℃延伸50 s。结果采用ΔCt值法，ΔCt=样品的Ct均值-内参的Ct均值，2-ΔΔCt即某样品初始cDNA的相对量。

1.6Western blot检测 根据预实验结果，加入不同浓度的重楼皂苷Ⅰ（终浓度依次为 0、1.5、3.0、6.0 μg/ml），每个浓度均设6孔。培养48 h，收集培养后的 ARPE-19细胞，提取总蛋白，用BCA法蛋白定量，上样，SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜，PBS洗膜，5%脱脂牛奶封闭1 h；PBS洗膜后加入一抗，4℃过夜；PBS洗膜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育0.5 h；洗膜；用增强化学发光试剂盒检测。结果扫描后，用Quantity one图像分析软件光密度分析，以β-actin为内参校正。

1.7统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，组间均数比较采用t检验，多组间数据比较采用重复测量设计的单因素方差分析。

2　结果

2.1MTT法检测重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的生长活性的影响 培养24 h后，6.0 μg/ml组（t= 23.317，P=0.000）、3.0 μg/ml组（t=16.266，P= 0.000）、1.5 μg/ml组（t=8.012，P=0.000）与0.75 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义；3.0 μg/ ml组（t=8.442，P=0.000）、1.5 μg/ml组（t= 15.224，P=0.000）与6.0 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义。表明重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的生长有抑制作用，其作用有浓度依赖性（F= 187.601，P=0.000）。见图1。

图1　MTT法检测重楼皂苷Ⅰ对　ARPE-19细胞增殖的影响

2.2重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞侵袭能力的影响

培养48 h后，与空白对照组比较，6.0 μg/ml组（t =14.221，P=0.000）、3.0 μg/ml组（t=8.754，P= 0.000）、1.5 μg/ml组（t=5.176，P=0.000）侵袭细胞数差异均有统计学意义；3.0 μg/ml组（t=7.537，P=0.000）、1.5 μg/ml组（t=11.507，P=0.000）与6.0 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义。表明重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的侵袭能力有抑制作用，其作用呈浓度依赖性（F=75.733，P= 0.000）。见图2。

图2　重楼皂苷Ⅰ对　ARPE-19细胞侵袭能力的影响×40

2.3重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞迁移能力的影响培养48 h后，与空白对照组比较，6.0 μg/ml组（t =28.853，P=0.000）、3.0 μg/ml组（t=18.804，P =0.000）、1.5 μg/ml组（t=10.860，P=0.000）划痕愈合率差异均有统计学意义；3.0 μg/ml组（t= 8.089，P=0.000）、1.5 μg/ml组（t=18.269，P= 0.000）与6.0 μg/ml组抑制率比较差异均有统计学意义。表明重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞的迁移能力有抑制作用，其作用呈浓度依赖性（F=281.005，P=0.000）。见图3。

2.4重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达的影响 重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达无明显影响。与空白对照组比较，6.0 μg/ml组（t=2.127，P=0.059）、3.0 μg/ml组（t= 2.041，P=0.069）、1.5 μg/ml组（t=2.095，P= 0.063）重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1 mRNA表达无明显影响。与空白对照组比较，6.0 μg/ml组（t=1.236，P=0.245）、3.0 μg/ml组（t=0.246，P=0.811）、1.5 μg/ml组（t=0.320，P=0.755）重楼皂苷Ⅰ对 ARPE-19细胞 ERK2 mRNA表达均无明显影响。见图4。

图3　重楼皂苷Ⅰ对　ARPE-19细胞迁移能力的影响×40

2.5重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响 重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2蛋白表达无明显影响，但对p-ERK1/2蛋白表达有明显抑制作用。与空白对照组比较，6.0 μg/ml组（t=20.549，P=0.000）、3.0 μg/ml组（t= 15.386，P=0.000）和1.5 μg/ml组（t=8.647，P= 0.000）重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞p-ERK1/2蛋白表达有明显抑制作用。与空白对照组比较，6.0 μg/ ml组（t=2.170，P=0.055）、3.0 μg/ml组（t= 0.447，P=0.664）和1.5 μg/ml组（t=0.935，P= 0.372）重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2蛋白表达无明显影响。见图5。

图4　重楼皂苷Ⅰ对　ARPE-19细胞　ERK1/2 mRNA表达的影响

3　讨论

PVR是多种细胞及细胞因子参与的对眼内损伤的过度修复反应［7］。人RPE细胞的增生、迁移是PVR发病的早期组织病理学机制。RPE细胞在PVR的发展中起着决定性的作用。抑制RPE细胞迁移、增生是治疗 PVR的方向之一。体外培养的RPE细胞（ARPE-19）有活体内RPE细胞所特有的结构和功能特点，可用于各种体外实验［8］，因此本研究选择ARPE-19细胞作为实验对象。

随着重楼皂苷Ⅰ增高，对ARPE-19细胞IR逐渐提高，提示重楼皂苷Ⅰ有抑制ARPE-19细胞增殖的活性。此外，通过划痕试验和Transwell试验分别检测了重楼皂苷Ⅰ对RPE细胞横向和纵向迁移的影响。因为PVR的本质是机体对损伤的过度修复。在PVR中，由于受到各种细胞因子的影响，视网膜色素上皮细胞除了水平方向运动外，纵向侵袭也是视网膜前、下增生膜形成的重要原因。结果表明，重楼皂苷Ⅰ明显抑制了ARPE-19细胞的侵袭和迁移。

图5　重楼皂苷Ⅰ对　ARPE-19细胞　ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响

目前就重楼皂苷Ⅰ抑制ARPE-19细胞增殖、侵袭和迁移的机制还不清楚。重楼活性单体能通过抑制ERK的磷酸化抑制结肠癌SW620细胞的增殖［9］。ERK也被称为丝裂原激活的MAPK通路，研究［10］显示，只有磷酸化的ERK才可以进入细胞核内，促进c-Fos与c-Jun等转录因子的磷酸化，参与ERK通路下游的一系列的激活反应。ERK主要参与细胞分化或增殖，促进细胞生存［11］，ERK1/2 MAPK通路阻断可抑制胃癌、乳腺癌等细胞凋亡、促进细胞侵袭，并且抑制miR-21及其靶基因表达［12-14］。本研究检测了不同浓度重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达以及对ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响。结果表明，重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞ERK1/2 mRNA表达以及对ERK1/2蛋白表达并无明显影响。重楼皂苷Ⅰ可能主要通过下调ERK1/2磷酸化的程度，从而抑制了ARPE-19细胞增殖，侵袭和迁移。

综上所述，本研究结果显示重楼皂苷Ⅰ能够抑制人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖、迁移，这可能与其抑制ERK1/2的磷酸化有关。这为中药重楼治疗PVR提供了一定的依据。

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Effects of PolyphyllinⅠ on proliferation and migration of human retinal epithelial cells line ARPE-19

Su Feifei，Lu Mudi，Zeng Huihong，et al
（Dept of Ophthalmology，Hezhou Renmin Hospital，Hezhou 542899）

Objective To study the effects of PolyphyllinⅠ on the proliferation and migration of human retinal pigment epithelial cell ARPE-19.Methods MTT assay was performed to investigate the effect of Polyphyllin I on the proliferation of ARPE-19 cells.Invasion ability of ARPE-19 cells was determined by a Matrigel invasion assay. Migration ability of ARPE-19 cells was determined by a wound healing assay.Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to detect ERK1/2 mRNA expression.Western blot was used to detect the expression of ERK1/2，p-ERK1/2.Results PolyphyllinⅠinhibited proliferation of ARPE-19 cells in a dose dependent manner（P＜0.01）.PolyphyllinⅠtreatment reduced migration and invasion capacity of ARPE-19 cells （P＜0.01）.PolyphyllinⅠ treatment has no effect on the ERK1/2 mRNA and ERK1/2 protein expression in ARPE-19 cells，but p-ERK1/2 protein expression was markedly decreased by treatment with PolyphyllinⅠ（P＜0.01）.Conclusion PolyphyllinⅠcan effectively inhibit the ARPE-19 cells proliferation and migration，it may be related to inhibition of the phosphorylation of ERK1/2 in ARPE-19 cells.This study provides some evidences for the efficacy of paradis in the treatment of proliferative vitreoretinopathy.

PolyphyllinⅠ；proliferation；migration；retinal pigment epithelial cells

R 774.1

A

1000-1492（2016）07-0956-05

2015-04-13接收

湖北省卫生计生委中医药、中西医结合科研指导性项目（编号：2013Z-B05）

1贺州市人民医院眼科，贺州 5428992湖北省中医院、湖北中医药大学临床医学院，武汉430061

苏菲菲，女，硕士，责任作者，E-mail：984625812@qq.com