超高效液相色谱同时测定人血清中4种抗癫痫药物的浓度

庄奕筠　张　吟　高雅莉　许秋霞福建医科大学附属第二医院药学部，福建泉州　362000

超高效液相色谱同时测定人血清中4种抗癫痫药物的浓度

庄奕筠张吟▲高雅莉许秋霞
福建医科大学附属第二医院药学部，福建泉州362000

目的 建立超高效液相色谱法测定人血清中卡马西平（CBZ）、苯妥英钠（PHT）、苯巴比妥（PB）、奥卡西平（OXC）活性代谢产物利卡西平（MHD）的浓度。方法 于2014年1月～2015年6月收集血清样品经甲醇沉淀蛋白后直接进样测定，采用Shim－pack XR－ODSⅢ柱（1．6 μm，75 L×2．0）。流动相为甲醇－水，采用梯度洗脱程序；扫描波长200~360 nm，检测波长为210 nm，流速：0.4 mL/min，柱温：35℃，进样体积：10 μL。结果CBZ、PHT、PB、MHD均能达到良好分离，与相邻峰的分离度（R）均＞1.5；线性范围分别为（1.00~32.00）μg/mL（r=0.9997）、（2.55~ 81.60）μg/mL（r=0.9997）、（2.35~75.20）μg/mL（r=0.9999）、（2.50~80.00）μg/mL（r=0.9998）；方法回收率＞97%；日内和日间精密度的相对标准偏差（RSD）均＜1.6%。结论 超高效液相色谱法（UPLC）快速、简便、准确，适用于临床治疗药物监测。

卡马西平；苯妥英钠；苯巴比妥；奥卡西平；利卡西平；超高效液相色谱法；血药浓度

[Abstract]Objective To establish a simple UPLC method for the simultaneous determination of carbamazepine(CBZ), phenytoin sodium(PHT),phenobarbital(PB),active metabolite of oxcarbazpine(OXC)-licarbazepine(MHD)in human serum.Methods The analytes were extracted by methanol protein precipitation in our hospital from January 2014 to June 2015.The extracts were injected onto an Shim-pack XR-ODSⅢcolumn.The mobile phase was methanol-water by gradient elution.The wavelength for scanning ranged from 200-360 nm,and the detective wavelength was 210 nm. The flow rate was 0.4 mL/min,and the column temperature was set at 35°C.The volume of loading sample was 10 μL. Results Carbamazepine,phenytoin sodium,phenobarbital and licarbazepine were separated well under the chromatographic condition,with the degree of separation(R)of adjacent peaks were greater than 1.5.The method was found to be linear over the concentration ranges investigated,1.00-32.00 μg/mL(r=0.9997)for CBZ,2.55-81.60 μg/mL(r=0.9997) for PHT,2.35-75.20 μg/mL(r=0.9999)for PB,2.50-80.00 μg/mL(r=0.9998)for MHD.The recoveries of CBZ,PHT,PB, OXC were more than 97%,and the intra-and inter-day validation were adequate with the RSDs of 1.6%or below. Conclusion UPLC is proved to be convenient,accurate and suitable to measure concentrations of the four analytes in clinical samples.

[Key words]Carbamazepine;Phenytoin sodium;Phenobarbital;Oxcarbazpine;Licarbazepine;UPLC;Serum concentration

卡马西平（carbamazepine，CBZ）、苯妥英钠（phenytoin sodium，PHT）、苯巴比妥（phenobarbital，PB）为临床上常用的传统一线抗癫痫药物，由于这三种抗癫痫药物的有效血药浓度范围较窄，患者之间个体差异较大，抗癫痫作用和毒性与在体内的血药浓度有很大的相关性，需要进行血药浓度监测和个体化给药。奥卡西平（oxcarbazepine，OXC）是新型抗癫痫药，2011年我国专家共识建议将其作为新诊断症状性部分性癫痫一线用药[1]，是联合治疗症状性部分性癫痫的首选配伍之一。OXC主要代谢产物是10-单羟基衍生物利卡西平（licarbazepine，MHD），体内真正起作用的有效成分是其代谢产物MHD[2-7]，目前临床上多监测MHD；OXC抗癫痫作用与CBZ、PHT和丙戊酸钠相似，但其具有更好的耐受性。目前临床上CBZ、PHT、PB、OXC除单一治疗外，临床上还存在多药联合应用治疗难治性癫痫，故研究建立同时测定人血清中这4种抗癫痫药物浓度的方法，对这类药物进行血药浓度监测[8，9]。为提高血药浓度监测的工作效率，本研究利用甲醇一步法沉淀蛋白处理血样，建立了同时测定此四种药物的UPLC方法，并测定了我院2014年1月~2015年6月的患者血样。该方法快速、准确、专属性强，可满足临床血药浓度测定的需求，为实施个体化给药、保证临床用药安全和有效奠定基础，现报道如下。

1　资料与方法

1.1材料

甲醇（HPLC级，批号：MS1922-001，美国TEDIA公司）；CBZ对照品（批号：100142-201105，中国食品药品检定研究院）；PHT对照品（批号：100210-201303，中国食品药品检定研究院）；PB对照品（批号：171222-200605，中国食品药品检定研究院）；MHD对照品（批号：20131227，南京康满林生物医药科技有限公司）；空白血浆（本院体检中心，健康体检者的混合血浆）；其他试剂为分析纯。

1.2仪器

超高效液相色谱仪，配有SPD-M20A二极管阵列检测器以及LC solution色谱工作站（LC-30AD，日本岛津公司）；离心机（2-5k，德国Sigma公司）；超纯水系统（Milli-Qacademic，美国Millipore公司）。

1.3色谱条件与系统适用性试验

色谱柱Shim-pack XR-ODSⅢ柱（1.6 μm，75 L×2.0，日本岛津公司）；梯度洗脱，见表1；流速0.4 mL/min，温度：35℃，进样体积：10 μL。

表1　梯度洗脱程序

1.4溶液的制备

1.4.1对照品贮备液的制备精密称取CBZ、PHT、PB、MHD对照品各适量，精密称量，用甲醇溶解得到质量浓度分别为1.00、1.02、0.94、1.00 mg/mL的储备液，置于-20℃冰箱中贮存。

1.4.2标准血样的制备分别精密量取对照品贮备液适量，用甲醇稀释成为适当浓度的系列混合工作液。取此工作液，加入适量空白人血清，制成含CBZ 1.00、 2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL，含PHT 2.55、5.10、10.20、20.40、40.80、81.60 μg/mL，含PB 2.35、4.70、9.40、18.80、37.60、75.20 μg/mL，含 MHD 2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg/mL的系列混合标准血样。

1.4.3质控血清的制备分别精密量取对照品贮备液适量，用甲醇稀释成为低、中、高对照品混合溶液。取此对照品混合溶液，加入适量空白人血清，制成含CBZ 3.00、6.00、20.00 μg/mL，含PHT 8.75、17.50、35.00 μg/mL，含PB 5.87、11.75、47.00 μg/mL，含MHD 6.25、12.50、50.00 μg/mL的低、中、高质控血清。

1.4.4血清样品预处理精密量取血清样品200 μL，加800 μL甲醇沉淀蛋白，旋涡混匀1 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤器滤过，取10 μL进样上机。

2　结果

2.1方法的专属性

在选定的样品处理方法和色谱分离条件下，CBZ、PHT、PB、MHD能够得到良好分离，峰形较好，与相邻峰的分离度（R）均＞1.5，且血清的内源性物质对本法测定无干扰，保留时间（retention time，RT）分别为9.87、8.96、7.12、7.65 min。测得空白血浆、空白血浆加对照品、患者服药后血样的色谱图，见图1。

在血清中加入可能与目标待测物联合使用的中枢神经系统药物，如舒必利（RT：2.42 min）、尼可刹米（RT：4.56 min）、多索茶碱（RT：5.68 min）、东莨菪碱（RT：6.44 min）、氯丙嗪（RT：10.25 min）、地西泮（RT：11.47 min）、阿普唑仑（RT：10.49 min）、艾司唑仑（RT：10.14 min）、氟奋乃静（RT：11.12 min）、双氯芬酸（RT：12.76 min）、布洛芬（RT：12.89 min）等，按色谱条件下检测。结果显示对实验目标检测均无干扰。

2.2线性关系考察与定量限

取系列混合标准血样各200 μL，按1.4.4项下方法处理，取上清液10 μL进样分析，以目标物峰面积Y对浓度X作线性回归，得回归方程与线性关系。结果表明：各药物的峰面积与浓度均呈良好的线性关系，见表2。并以信噪比S/N=10，计算定量限（limit of quantity，LOQ）。

2.3精密度试验

取低、中、高3个浓度质控血清，按1.4.4方法处理，取上清液10 μL进样分析。实验于同日内平行操作测定5次，计算得日内相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）；连续5 d每天操作测定1次，计算得日间RSD。见表3。

图1　4种药物同时检测的高效液相色谱图

表2　UPLC法同时测定血清中CBZ、PB、PHT及MHD的标准曲线和线性范围

2.4回收率试验

取低、中、高3个浓度质控血清，按1.4.4方法处理，每个浓度平行制备5份，取上清液10 μL进样分析，根据所得图形峰面积代入标准曲线求出各样品浓度，求得的样品浓度与理论的样品浓度之比，即为方法回收率；由标准血样经提取后测得的峰面积与对应浓度对照品溶液测得的峰面积之比，计算提取回收率，见表3。

表3　UPLC法同时测定血清中CBZ、PB、PHT及MHD的方法回收率和精密度试验

2.5稳定性试验

取对照品的储备液，4℃冷藏保存，分别在1、3、5、7、60 d后，配制4种混合对照溶液100 μg/mL直接进样测定（n=5），峰面积RSD均<5%，表明储备液至少在60 d稳定。

3　讨论

本文采用甲醇沉淀蛋白的方法对血样进行沉淀蛋白前处理，该方法简单、快速。色谱条件的选择尤其是流动相的组成直接影响到日常工作的开展。相关文献[10-14]中使用的流动相均含有无机盐或酸，平衡流动相和冲洗色谱柱时间较长，干扰因素多，不利于色谱柱的保护。本文采用的流动相为无盐的甲醇-水体系，对色谱柱及仪器的损害小，柱子的冲洗也较简单、快速。采用梯度洗脱可提高分离度、缩短分离时间和提高分离精度，但是由于流动相比例在不断变化，背景会存在溶剂峰。

本文所采用的二极管阵列检测器，能够在给定的200~360 nm范围内实时采集每一色谱峰的光谱，并计算其最大吸收波长。通过多种波长下的吸光度比较，最后确定在210 nm处这四种药物均有最大吸收，而且分离良好。柱温选择35℃可以降低柱压，延长柱子的使用寿命。

本研究建立同时测定4种抗癫痫药物的UPLC方法对于临床常用舒必利等11种药物进行检测，与文中4种目标药物不存在干扰，适用于临床治疗药物血药浓度的监测。有研究收集临床上服用CBZ、PHT、PB、OXC患者的血样，应用建立的UPLC法测定58例患者的血药浓度，年龄范围在10~81岁，用本方法测定稳态谷浓度。其中单独应用一种药物的病例43例，存在联合应用两种及以上药物的病例有15例（部分血样有联合应用丙戊酸钠VPA）。血药浓度的监测结果表明：在监测的58例病例中，77.6%的患者血药浓度在有效浓度范围内，临床症状控制较好；15.5%的患者血药浓度低于有效范围；6.9%的患者血药浓度高于有效浓度，患者出现中毒症状，服用PHT的患者特别是老年人较易中毒，其中有1例患者测得PHT血药浓度高达84.94 μg/mL。在联合用药方面，常见的为CBZ、PHT或CBZ、VPA或OXC、VPA，也有存在PHT、OXC、

PB三种联用的。因CBZ、PHT、PB、OXC及VPA等抗癫痫药物经常存在多种药物联合应用，药物间相互作用，可能加速或抑制其他药物的代谢，而影响药物的疗效，有必要对此类药物进行血药浓度监测。由于患者存在个体差异，实施个体化给药非常必要[15]。随着临床药物监测知识的普及和应用的深入，医生通过监测患者血药浓度，结合临床神经系统症状、患者并发症、认知功能及影像学检查，制订调整给药方案，实现个体化给药，从而有效控制癫痫发作，提高治疗效果。

[1]中华医学会神经病学分会脑电图与癫痫学组.抗癫痫药物应用专家共识[J].中华神经科杂志，2011，44（4）：56-64.

[2]陆志城，佘清声.奥卡西平的药代动力学及其立体选择性[J].中国临床药理学杂志，2003，19（2）：134-137.

[3]张全英，徐文俊，俞蕴莉.高效液相色谱法测定癫痫患者血浆中奥卡西平活性代谢物的浓度及其血药浓度与疗效关系评价[J].中国生化药物杂志，2015，35（1）：106-109.

[4]汝国庆.奥卡西平血药浓度与癫痫治疗疗效的临床研究[J].北方药学，2014，11（12）：91-95.

[5]汪洋，宋新文，许琼，等.癫痫患儿奥卡西平活性代谢产物血药浓度监测结果回顾分析[J].中国现代应用药学，2012，29（5）：464-465.

[6]邹蓉，赵合庆，戴永萍，等.年龄及联合用药对癫痫患者奥卡西平血药浓度的影响[J].临床神经病学杂志，2015， 28（2）：110-113.

[7]徐善森，张媞，周敬凯，等.高效液相色谱法测定人血浆中拉莫三嗪、奥卡西平及其代谢物浓度[J].中国临床药理学杂志，2015，31（12）：1176-1179.

[8]冯惠平，吴佳滨，李碧峰，等.反相高效液相色谱法同时测定苯妥英钠、卡马西平的血药浓度[J].临床医药，2008，17（7）：54-55.

[9]苏煌财，林玉仙，张宏.高效液相色谱法同时测定苯妥英钠和卡马西平的血药浓度[J].药品评价，2012，9（26）：31-32.

[10]杨洁，焦正，施孝金.高效液相色谱法同时测定人血浆中6种抗癫痫药物及两种活性代谢物的浓度[J].中国药学杂志，2006，41（24）：1899-1902.

[11]刘颖，王丽，何大可.RP-HPLC法同时测定卡马西平拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英钠及环氧卡马西平的血清浓度[J].中国临床药理学与治疗学，2005，10（8）：846-851.

[12]刘亦伟，王长连，黄品芳.高效液相色谱法同时测定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度[J].中国医院药学杂志，2012，32（23）：1660-1662.

[13]董超，王来成，吕冬梅.苯妥英钠血药浓度监测中的中毒影响因素分析[J].中国药房，2012，23（44）：4185-4186.

[14]祝文兵，阳利龙，何周康.高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平血药浓度[J].儿科药学杂志，2015，21（6）：38-41.

[15]韩勇，陈东生，张玉.临床药学实验室的药物个体化治疗药学服务内容与实践[J].中国医院药学杂志，2013，33（9）：739-741.

Study on simultaneous analysis of four antiepileptic drugs in human serum by UPLC

ZHUANG YijunZHANG YinGAO YaliXU Qiuxia
Department of Clinical Pharmaceutics Room,the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou 362000,China

R969

B

1673-9701（2016）12-0105-03

福建省科技厅社会发展引导性项目（2015Y00 55）；福建省卫计委青年科研课题（2015-1-60）

2016-01-28）